Fermentų veikimo mechanizmas. Fermentai
fermentų biologinė katalizė transaminacija
Daugelio fermentų erdvinės struktūros atradimas naudojant rentgeno spindulių difrakcijos analizę suteikė patikimą pagrindą kurti racionalias jų veikimo mechanizmo schemas.
Fermentų veikimo mechanizmo nustatymas yra labai svarbus norint atskleisti struktūros ir funkcijų ryšius įvairiose biologiškai aktyviose sistemose.
Lizocimas randamas įvairiuose gyvūnų ir augalų audiniuose, ypač ašarų skystyje ir kiaušinio baltyme. Lizocimas veikia kaip antibakterinis agentas, katalizuojantis daugelio bakterijų ląstelių sienelių hidrolizę. Šis polisacharidas susidaro kintant N-acetilmurano rūgšties (NAM) liekanoms, susietoms β-1,4-glikozidine jungtimi (polisacharidų grandinės yra susietos trumpais peptidų fragmentais).
Bakterinis polisacharidas yra labai sudėtingas netirpus junginys, todėl labai hidrolizuojami oligosacharidai, sudaryti iš NAG liekanų, dažnai naudojami kaip lizocimo substratai.
Vištienos kiaušinio baltymo lizocimą sudaro viena polipeptidinė grandinė, kurioje yra 129 aminorūgščių liekanos; jo molekulinė masė yra 14 600. Aukštą fermento stabilumą užtikrina keturi disulfidiniai tilteliai.
Informaciją apie aktyvųjį centrą ir katalizinio proceso tipą D. Phillipsas gavo 1965 m. remiantis lizocimo ir jo kompleksų su inhibitoriais rentgeno spindulių difrakcijos tyrimais. Lizocimo molekulė turi elipsoido formą, kurios ašys yra 4,5*3*3 nm; Tarp dviejų molekulės pusių yra „tarpas“, kuriame jungiasi oligosacharidai. Tarpo sieneles daugiausia sudaro nepolinių aminorūgščių šoninės grandinės, kurios užtikrina nepolinių substrato molekulių surišimą, taip pat apima šonines polinių aminorūgščių grandines, kurios gali sudaryti vandenilinius ryšius su substrato acilamino ir hidroksilo grupės. Tarpo dydis leidžia apgyvendinti oligosacharido molekulę, kurioje yra 6 monosacharidų liekanos. Rentgeno spindulių difrakcijos analize neįmanoma nustatyti substrato, pavyzdžiui, NAG 6 heksasacharido, surišimo pobūdžio. Tuo pačiu metu fermento kompleksai su inhibitoriumi trisacharidu NAG 3 yra stabilūs ir gerai ištirti. NAG 3 prisijungia prie plyšių fermento paviršiuje, sudarydamas vandenilinius ryšius ir van der Waals kontaktus; tuo pačiu jis užpildo tik pusę tarpo, kuriame gali prisijungti dar trys monosacharidų likučiai. Neredukuojantis galas (cukrus A) yra tarpo pradžioje, o redukuojantis galas (cukrus C) yra jo centrinėje dalyje; Cukraus likučiai A, B ir C turi kėdės konformaciją. Fermento-substrato komplekso modelio konstravimas buvo pagrįstas prielaida, kad kai substratas NAG 6 jungiasi, realizuojama tokia pati sąveika kaip ir NAG 3 surišimo metu. Fermento modelyje trys cukraus likučiai (vadinami D, E ir F likučiais) buvo patalpinti į plyšį; kiekvienas paskesnis cukrus buvo dedamas taip, kad jo konformacija būtų tokia pati (kiek įmanoma) kaip ir pirmųjų trijų cukrų. Kaip modelio komplekso dalis, visos cukraus liekanos įgyvendina efektyvią nekovalentinę sąveiką su aminorūgščių liekanų šoninėmis ir peptidinėmis grupėmis, sudarančiomis plyšį.
Identifikuojant katalizines grupes buvo natūralu sutelkti dėmesį į tas, kurios yra šalia skaidomos glikozidinės jungties fermento-substrato komplekse ir gali būti protonų donorais arba akceptoriais. Paaiškėjo, kad ji buvo vienoje padalijamos obligacijos pusėje, per atstumą? 0,3 nm (nuo glikozidinės jungties deguonies), yra Glu-35 karboksilo grupė, o kitoje (tuo pačiu atstumu) yra Asp-52 karboksilo grupė, jų aplinka labai skiriasi. Glu-35 yra apsuptas hidrofobinių liekanų; galima daryti prielaidą, kad esant optimaliam fermento pH ši grupė yra nejonizuotoje būsenoje. Asp-52 aplinka yra aiškiai poliarinė; jo karboksilo grupė dalyvauja kaip vandenilio akceptorius sudėtingame vandenilio jungčių tinkle ir tikriausiai veikia jonizuotoje būsenoje.
Siūloma tokia oligosacharido hidrolizės katalizinio proceso schema. Nejonizuota Glu-35 karboksilo grupė veikia kaip protonų donorė, tiekdama jį glikozidinio deguonies atomui tarp cukraus D C (1) atomo ir cukraus E atomo C (4) (bendros rūgšties katalizės etapas). ; tai veda prie glikozidinės jungties skilimo. Dėl to cukraus likutis D pereina į karbokationo būseną su teigiamai įkrautu anglies atomu C (1) ir įgauna pusės kėdės konformaciją. Neigiamas Asp-52 karboksilato grupės krūvis stabilizuoja karbokataciją. NAG 2 likutis (E+F cukrus) difunduoja iš aktyvios vietos srities. Tada sureaguoja vandens molekulė; jo protonas patenka į Glu-35, o OH - - grupė patenka į D liekanos C atomą (1) (pagrindinės katalizės stadija). NAG 4 liekana (cukrai A+B+C+D) palieka aktyviosios vietos sritį, o fermentas grįžta į pradinę būseną.
Galvijų kasos ribonukleazė (RNazė) hidrolizuoja RNR tarpnukleotidinius ryšius šalia pirimilino vienetų, kurie lieka esterinti 3" padėtyje. Fermentas, kartu su kitomis nukleazėmis, plačiai naudojamas analizuojant RNR struktūrą.
Rnazę sudaro viena polipeptidinė grandinė, kurioje yra 124 aminorūgščių liekanos, o jos molekulinė masė yra 13 680; molekulė turi keturias disulfidines jungtis. RNazė yra pirmasis fermentas, kurio pirminė struktūra buvo nustatyta.
Remdamasis ribonukleazės renatūracijos tyrimo rezultatais, K. Afinsenas pirmasis aiškiai suformulavo mintį, kad baltymo erdvinę struktūrą lemia pirminė jo struktūra.
1958 metais F. Richardsas parodė, kad tam tikromis sąlygomis subtilizinas suardo Ala-20 – Ser-21 peptidinę jungtį RNazėje. Gauti fragmentai buvo pavadinti S-peptidu (1-20 liekanos) ir S-baltymu (21-124 liekanos); dėl nekovalentinės sąveikos fragmentai sudaro kompleksą, vadinamą RNazė S. Šis kompleksas turi beveik visišką katalizinį natūralaus fermento aktyvumą; izoliuotoje formoje S-peptidas ir S-baltymas yra neaktyvūs. Be to, buvo nustatyta, kad sintetinis peptidas, savo seka identiškas S-peptido fragmentui, turinčiam 1-13 liekanas, atkuria S baltymo aktyvumą, tačiau trumpesnis peptidas, turintis 1-11 liekanas, neturi šios galimybės. Gauti duomenys leido daryti išvadą, kad atitinkamos His-12 arba Met-13 liekanos (arba abi šios liekanos) yra įtrauktos į aktyvų fermento centrą.
Tiriant pH įtaką RNazės aktyvumui, išryškėjo svarbus baltymų funkcinių grupių, kurių pK 5,2 ir 6,8, vaidmuo; tai leido manyti, kad kataliziniame procese dalyvauja histidino likučiai.
Kai RNazė karboksilinama jodacetatu, kai pH 5,5, t.y. sąlygomis, kai vyrauja histidino likučių modifikavimas, buvo pastebėtas visiškas aktyvumo praradimas; modifikuotame fermente yra 1 molis karboksimetilo grupių 1 moliui baltymo. Dėl to susidaro dvi fermento monokarboksimetileno formos. Vienoje formoje His-12 likutis yra karboksimetilintas, o kitoje His-119 yra karboksimetilintas. His-119 buvo daugiausia modifikuotas.
Šie duomenys rodo, kad His-12 ir His-119 yra aktyvioje vietoje ir kad vieno iš jų modifikavimas neleidžia modifikuoti kito.
Rentgeno spindulių difrakcijos tyrimų metu buvo išaiškinta RNazės S ir RNazės S komplekso su inhibitoriais erdvinė struktūra. Molekulė turi inksto formą, aktyvusis centras yra įduboje, kurioje yra His-12, His-119 ir Lys-41 likučiai.
Hidrolizė įvyksta dėl konjuguoto His-12 ir His-119 likučių, kurie atlieka rūgščių-šarmų katalizę, veikimo. Žemiau esančioje diagramoje parodyti katalizinio proceso etapai:
1. Substratas yra aktyvioje vietoje; His-12, His-119 ir Lys-41 yra šalia neigiamai įkrauto fosfato.
2. Veikiant His-12 kaip bazei, kuri priima protoną iš ribozės 2"-OH grupės, ir His-119 kaip rūgštį, kuri paduoda protoną fosfato deguonies atomui, pirmiausia susidaro tarpinis kompleksas, o tada 2,3" ciklinis fosfatas.
3. Vietoj prarasto produkto patenka vanduo, atiduodamas protoną His-119, o OH – fosfatui, tuo pačiu protonas iš His-12 eina į ribozės deguonies atomą, susidaro antrasis produktas ir fermentas grįžta į pradinę būseną.
Chimotripsiną profermento – chimotripsinogeno pavidalu išskiria stuburinių gyvūnų kasa; dvylikapirštėje žarnoje, veikiant tripsinui, suaktyvėja profermentas. Fiziologinė chimotripsino funkcija yra baltymų ir polipeptidų hidrolizė. Chimotripsinas atakuoja daugiausia peptidines jungtis, kurias sudaro tirozino, triptofano, cenilalanino ir metionano karboksilo liekanos. Jis taip pat veiksmingai hidrolizuoja atitinkamų aminorūgščių esterius. Chimotripsino molekulinė masė yra 25 000, molekulėje yra 241 aminorūgšties liekana. Chimotripsiną sudaro trys polipeptidinės grandinės, sujungtos disulfidiniais tilteliais.
Chimotripsino aktyviosios vietos funkcinės grupės buvo nustatytos naudojant negrįžtamus inhibitorius. Ser-195 liekana buvo modifikuota diizopropilfluorfosfatu ir fenilmetilsulfofluoridu, o His-122 liekana modifikuota N-tosil-L-fenilalanino chlorometilketonu. Tiriant p-nitrofenilacetato hidrolizės kinetiką buvo atrastas dviejų etapų chimotripsino hidrolizės procesas.
Būdingas nagrinėjamo proceso bruožas yra kovalentinio tarpinio junginio – acilo fermento – susidarymas. Acilinama katalizinė grupė buvo identifikuota kaip liekana Ser-195. Fermento vykdomas katalizės mechanizmas buvo pasiūlytas dar prieš nustatant erdvinę baltymo struktūrą, tačiau vėliau buvo patobulintas. Visų pirma, tyrimai, naudojant 18 H 2 O, leido įrodyti acilo fermento susidarymą peptidų hidrolizės metu.
Trimatė struktūra, kurios skiriamoji geba yra 0,2 nm, buvo nustatyta D. Blow atlikus rentgeno spindulių difrakcijos analizę. 1976 metais Molekulė turi elipsoido formą, kurios ašys yra 5,4 * 4 * 4 nm. Kristalografinių tyrimų rezultatai patvirtino prielaidą, kad Ser-195 ir His-57 likučiai yra arti vienas kito. Ser-195 hidroksilo grupė yra ~0,3 nm atstumu nuo His-57 imidazolo žiedo azoto atomo. Įdomiausias faktas buvo tai, kad 1 žiedo padėtyje esantis azoto atomas yra ~0,28 nm atstumu nuo Asp-102 šoninės grandinės karboksilo grupės deguonies atomo ir užima palankią padėtį formuotis vandenilinė jungtis.
Reikėtų pažymėti, kad cheminiai tyrimai negalėjo atskleisti Asp-102 dalyvavimo aktyviosios vietos funkcionavime, nes ši liekana yra palaidota giliai molekulėje.
Šiuo metu manoma, kad trys likučiai Asp-102, His-57 ir Ser-195 sudaro krūvio perdavimo sistemą, kuri atlieka lemiamą vaidmenį katalizės procese. Sistemos veikimas užtikrina veiksmingą His-57, kaip rūgščių-šarmų katalizatoriaus, dalyvavimą katalizėje ir padidina Ser-195 reaktyvumą su užpultos jungties karboksilo anglimi.
Pagrindinis katalizės elementas yra protono perkėlimas iš Ser-195 į His-57. Tuo pačiu metu serino deguonies atomas atakuoja substrato karbonilo anglies atomą ir pirmiausia susidaro tarpinis tetraedrinis junginys (1), o paskui acilo fermentas (2). Kitas žingsnis yra deacilinimas. Vandens molekulė patenka į krūvio perdavimo sistemą, o OH jonas tuo pat metu atakuoja acilo fermento acilo grupės karbonilo anglies atomą. Kaip ir acilinimo etape, susidaro tetraedrinis tarpinis produktas (4). Tada His-57 tiekia protoną Ser-195 deguonies atomui, todėl išsiskiria acilo produktas; jis pasklinda tirpale, ir fermentas grįžta į pradinę būseną.
Karboksipeptidazę A kaip profermentą išskiria stuburinių gyvūnų kasa. Aktyvus fermentas susidaro plonojoje žarnoje, dalyvaujant chimotripsinui. Fermentas nuosekliai atskiria C-galo aminorūgščių liekanas nuo peptidinės grandinės, t.y. yra egzopeptidazė.
Karboksipeptidazę A sudaro viena polipeptidinė grandinė, turinti 307 aminorūgščių liekanas; molekulinė masė yra 34 470. Baltymo aminorūgščių seką 1969 metais nustatė R. Bredschow.
Išsiaiškinti fermento veikimo mechanizmą pavyko tik atlikus rentgeno difrakcijos tyrimus. Fermento ir jo komplekso su Gly-Tyr dipeptidu (substrato modelis) erdvinę struktūrą nustatė W. Lipscomb. Fermento molekulė turi elipsoido formą, kurios ašys yra 5,0 * 4,2 * 3,8 nm; aktyvi vieta yra įduboje, kuri virsta gilia nepoline kišene. Aktyvaus centro zonoje yra lokalizuotas cinko jonas (jo ligandai yra likučių Glu-72, His196, His-69 šoninės grandinės ir vandens molekulė), taip pat funkcinės grupės, dalyvaujančios substrato surišime ir katalizėje - liekanos. Arg-145, Glu-270 ir Tyr-248.
Lyginamoji fermento ir jo komplekso su Gly-Tyr struktūrų analizė suteikė svarbios informacijos apie fermento ir substrato komplekso struktūrą. Visų pirma, buvo nustatyta, kad komplekso susidarymo metu Tyr-248 hidroksilo grupė pasislenka 1,2 nm, palyginti su jos padėtimi laisvajame fermente (ty maždaug 1/3 molekulės skersmens).
Pagal katalizinio proceso schemą Glu-270 karboksilato grupė aktyvuoja reakcijos sferoje esančią vandens molekulę, ištraukdama iš jos protoną; susidaręs OH- jonas atlieka nukleofilinį ataką prieš suskaidomos jungties karbonilo anglį. Tuo pačiu metu Tyr-248 hidroksilo grupė, esanti šalia suskilusios peptidinės jungties azoto atomo, dovanoja jai protoną. Dėl to atakuota peptidinė jungtis nutrūksta, o susidarę produktai palieka aktyviąją centro zoną. Toliau pateiktoje diagramoje parodyta bendra pagrindinė katalizė.
Aspartato aminotransferazė katalizuoja grįžtamąją transamininimo reakciją.
Fermentinę transamininimo reakciją atrado A.E. Braunsteinas ir M.G. Kritsmanas 1937 m tiriant fermentinį preparatą iš balandžių raumenų. Vėlesni tyrimai parodė, kad transaminacijos reakcijos yra plačiai paplitusios gyvojoje gamtoje ir atlieka svarbų vaidmenį sujungiant azoto ir energijos apykaitą.
1945 metais buvo nustatyta, kad piridoksal-5"-fosfatas (PLP) yra aminotransferazių kofermentas. AAT molekulė yra dimeras, sudarytas iš identiškų subvienetų. Tirtų stuburinių gyvūnų širdies raumenyje yra du izofermentai - citoplazminis (cAAT0 ir mitochondrijų (mAAT) aminotransferazės.
Pirminė cAAT struktūra iš širdies raumens buvo nustatyta 1972 m. Yu.A. Ovčinikovas ir A.E. Brainšteinas. Baltymų polipeptidinėje grandinėje yra 412 aminorūgščių liekanų; molekulinė masė yra 46 000.
Bendrąją piridoksalio katalizės teoriją sukūrė A.E. Braunsteinas ir M.M. Šemjakinas 1952–1953 m., o kiek vėliau - D.E. Metzleris ir E.E. Snell. Remiantis šia teorija, katalizinį piridoksalio fermentų poveikį lemia piridoksalio fosfato aldehidinės grupės gebėjimas sudaryti aldiminus (Schiff bazes) sąveikaujant su aminais, įskaitant aminorūgštis.
Gautoje fosfopiridoksildenamino rūgštyje yra konjuguotų dvigubų jungčių sistema, pagal kurią elektronų išstūmimas iš b-anglies atomo palengvina šio atomo susidariusių ryšių nutrūkimą.
Šiuolaikinės idėjos apie fermentinio transaminacijos mechanizmą, sukurtos A.E. Braunsteinas ir jo bendradarbiai yra pirmiau aptartos teorijos plėtojimas. Pradinėje būsenoje piridoksalio fosfato aldehido grupė sudaro aldimino ryšį su aktyvaus centro (I) Lys-258 liekanos e-amino grupe. Kai jungiasi aminorūgštis, susidaro Michaelio kompleksas (II), o po to - aldiminas tarp piridoksalio fosfato ir substrato (III). Dėl vėlesnių transformacijų per tarpines (IV) ir (V) stadijas susidaro okso rūgštis (VI). Tai užbaigia pirmąją transaminacijos pusinę reakciją. Kartodami tuos pačius veiksmus „atvirkščia kryptimi“ su nauja hidroksi rūgštimi, susidaro antroji pusinė reakcija, užbaigianti katalizinio transaminavimo ciklą.
Mioglobinas ir hemoglobinas
Šie du baltymai dažnai vadinami kvėpavimo fermentais. Jų sąveika su substratu – deguonimi – buvo išsamiai ištirta, visų pirma remiantis didelės raiškos rentgeno spindulių difrakcijos analize. Trimatę mioglobino struktūrą nustatė J. Kendrew 1961 m., o trimatę hemoglobino struktūrą M. Perutzas 1960 m.
Mioglobino molekulė yra kompaktiškos formos - 4,5 * 3,5 * 2,5 nm, polipeptidinė grandinė sudaro 8 spiralinius skyrius, žymimus raidėmis A iki H. Ji yra specializuotai išdėstyta aplink didelį plokščią geležies turintį hemo žiedą. Hemas yra porfirino ir dvivalenčios geležies kompleksas.
Hemo polinės propiono rūgšties grandinės yra molekulės paviršiuje, likusi hemo dalis yra panardinta į rutuliuką. Hemo sujungimas su baltymu vyksta dėl koordinacinio ryšio tarp geležies atomo ir histidino atomo, lokalizuoto spirale F; tai vadinamasis proksimalinis histidinas. Kitas svarbus histidino likutis, distalinis histidinas, yra hemo kišenėje spiralės E viduje; jis yra priešingoje geležies atomo pusėje didesniu atstumu nei proksimalinis histidinas. Sritis tarp geno geležies ir distalinio histidino deoksimioglobine yra laisva, o lipofilinė O 2 molekulė gali prisijungti prie hemo geležies, užimdama šeštąją koordinavimo poziciją. Unikali mioglobino, kaip ir hemoglobino, savybė yra jų gebėjimas grįžtamai surišti O 2 neoksiduojant hemo Fe 2+ į Fe 3+. Tai įmanoma, nes hidrofobinėje hemo kišenėje sukuriama aplinka su maža dielektrine konstanta, iš kurios išstumiamas vanduo.
O2 prisijungus prie geležies atomo, pastarasis pasislenka maždaug 0,06 nm ir atsiduria porfirino žiedo plokštumoje, t.y. energetiškai palankesnėje padėtyje. Manoma, kad toks judėjimas atsirado dėl to, kad deoksimioglobino Fe 2+ jonas yra didelio sukimosi būsenoje, o jo spindulys per didelis, kad tilptų hemo porfirino žiedo plokštumoje. Kai O 2 jungiasi, Fe 2+ jonas pereina į žemo min būseną ir jo spindulys mažėja; Dabar Fe 2+ jonas gali persikelti į porfirino žiedo plokštumą.
Hemoglobinas yra pagrindinis raudonųjų kraujo kūnelių komponentas, tiekiantis deguonį iš plaučių į audinius, o anglies dioksidą iš audinių į plaučius. Įvairių tipų hemoglobinai skiriasi kristalų forma, tirpumu ir afinitetu deguoniui. Taip yra dėl baltymų aminorūgščių sekos skirtumų; hemo komponentas yra vienodas visų rūšių stuburinių gyvūnų ir kai kurių bestuburių hemoglobinuose.
Žmogaus hemoglobinas yra tetrameras, susidedantis iš keturių subvienetų, dviejų b-subvienetų ir dviejų b-subvienetų, turinčių atitinkamai 141 ir 146 aminorūgščių liekanas. Tarp pirminių b ir b subvienetų struktūrų yra didelė homologija, o jų polipeptidinių grandinių konformacija taip pat yra panaši.
Hemoglobino molekulė yra sferinės formos, kurios skersmuo yra 5,5 nm. Keturi subvienetai yra supakuoti į tetraedro formą.
Rentgeno spindulių difrakcijos duomenys parodė, kad hemoglobino prisotinimas deguonimi yra susijęs su daugybe pokyčių. Esant mažai skyrai, nustatyta, kad tokiu atveju struktūra tampa kompaktiškesnė (β-grandinių Fe atomai vienas prie kito priartėja maždaug 0,6-0,7 nm), subvienetai vienas kito atžvilgiu sukasi ir antros eilės. ašys 10-15 o. Didelės skiriamosios gebos tyrimo rezultatai rodo, kad ypač reikšmingi pokyčiai vyksta kontaktų srityje.
Iki šiol, remiantis rentgeno spindulių difrakcijos tyrimais ir daugybe kitų metodinių metodų, buvo padaryta didelė pažanga, siekiant išsiaiškinti norimų savybių turinčių fermentų veikimo mechanizmą, pagrįstą pažanga genų inžinerijos srityje. Tai atveria plačias galimybes patikrinti šiuolaikinių idėjų apie fermentų veikimo mechanizmą pagrįstumą ir sukurti pagrindinę fermentinės katalizės teoriją.
Paprastų ir sudėtingų fermentų veikimo mechanizmas yra vienodas, nes jų molekulėse esantys aktyvieji centrai atlieka panašias funkcijas.
Pagrindiniai fermentų veikimo mechanizmai buvo ištirti XX amžiaus pradžioje. 1902 metais anglų chemikas A. Brownas pasiūlė, kad fermentas, veikiantis substratą, su juo sudarytų tarpinį fermentą – substrato kompleksą. Tuo pačiu metu ir nepriklausomai nuo A. Browno tokią pat prielaidą padarė prancūzų mokslininkas V. Henri. 1913 metais L. Michelis ir M. Mentenas patvirtino ir išplėtojo idėjas apie fermentų veikimo mechanizmą, kurias galima pavaizduoti diagramos pavidalu:
kur E yra fermentas, S yra substratas, P yra produktas.
Pirmajame fermentinės katalizės etape susidaro fermento-substrato kompleksas, kuriame fermentas ir substratas gali būti susieti joniniais, kovalentiniais ar kitokiais ryšiais. ES kompleksas susidaro beveik akimirksniu.
Antrame etape substratas, veikiamas su juo susijusio fermento, yra modifikuojamas ir tampa labiau prieinamas atitinkamai cheminei reakcijai. Šis etapas lemia viso proceso greitį.
Trečiajame etape įvyksta cheminė reakcija, kurios metu susidaro reakcijos produkto kompleksas su fermentu.
Galutinis procesas yra reakcijos produkto išsiskyrimas iš komplekso.
Šią diagramą galima iliustruoti konkrečiu pavyzdžiu. Panagrinėkime aminotransferazių, kurios katalizuoja amino ir keto rūgščių transaminacijos procesą, veikimo mechanizmą. Aminotransferazė yra holofermentas, kurio kofermentas yra piridoksalio fosfatas, kovalentiškai susietas su apofermentu. Katalizėje dalyvaujanti aktyvi grupė yra kofermento aldehidinė grupė, todėl, kad būtų paprasčiau pavaizduoti fermento veikimo mechanizmą, holofermentą pavadinsime taip.
Pirmajame fermentinės katalizės etape susidaro fermento-substrato kompleksas, kuriame fermentas ir substratas yra susieti kovalentine jungtimi:
Antrame etape substratas transformuojamas, išreikštas tautomeriniu pertvarkymu, dėl kurio susidaro kompleksas ":
Dėl cheminės reakcijos (šiuo atveju vyksta hidrolizė) susidaro keto rūgštis, o fermentas iš komplekso išsiskiria piridoksamino fermento pavidalu. Kad nebūtų pažeistas vienas iš pagrindinių katalizės principų, šiame procese dalyvauja keto rūgštis. Tolesnis procesas gali būti pavaizduotas šioje diagramoje:
Šis pavyzdys ne tik iliustruoja fermento veikimo mechanizmą, bet ir leidžia suprasti, kad biocheminis procesas gali būti išreikštas kaip paprastų cheminių substrato virsmų grandinė.
Biologinė chemija Lelevičius Vladimiras Valerjanovičius
Fermentų veikimo mechanizmas
Fermentų veikimo mechanizmas
Bet kurioje fermentinėje reakcijoje išskiriami šie etapai:
E+S? ?E+P
kur E yra fermentas, S yra substratas, yra fermento-substrato kompleksas, P yra produktas.
Fermentų veikimo mechanizmą galima vertinti iš dviejų pozicijų: cheminių reakcijų energijos pokyčių ir įvykių aktyviajame centre požiūriu.
Cheminių reakcijų metu keičiasi energija
Bet kokios cheminės reakcijos vyksta pagal du pagrindinius termodinamikos dėsnius: energijos tvermės dėsnį ir entropijos dėsnį. Pagal šiuos dėsnius bendra cheminės sistemos ir jos aplinkos energija išlieka pastovi, o cheminė sistema linkusi mažėti (didinti entropiją). Norint suprasti cheminės reakcijos energiją, neužtenka žinoti į reakciją patenkančių ir iš jos išeinančių medžiagų energijos balansą. Būtina atsižvelgti į energijos pokyčius tam tikros cheminės reakcijos metu ir fermentų vaidmenį šio proceso dinamikoje.
Kuo daugiau molekulių turi energijos, viršijančios Ea lygį (aktyvacijos energija), tuo didesnis cheminės reakcijos greitis. Cheminės reakcijos greitį galite padidinti kaitindami. Tai padidina reaguojančių molekulių energiją. Tačiau aukšta temperatūra yra pražūtinga gyviems organizmams, todėl ląstelėse naudojami fermentai cheminėms reakcijoms paspartinti. Fermentai užtikrina didelį reakcijų greitį optimaliomis ląstelėje esančiomis sąlygomis, sumažindami Ea lygį. Taigi fermentai sumažina energijos barjero aukštį, todėl padidėja reaktyviųjų molekulių skaičius ir atitinkamai padidėja reakcijos greitis.
Aktyvios vietos vaidmuo fermentų katalizėje
Atlikus tyrimus buvo įrodyta, kad fermento molekulė, kaip taisyklė, yra daug kartų didesnė už substrato molekulę, kurią šis fermentas chemiškai transformuoja. Tik nedidelė fermento molekulės dalis liečiasi su substratu, dažniausiai nuo 5 iki 10 aminorūgščių liekanų, kurios sudaro aktyviąją fermento vietą. Likusių aminorūgščių liekanų vaidmuo yra užtikrinti teisingą fermento molekulės konformaciją, kad cheminė reakcija vyktų optimaliai.
Aktyvioji vieta visuose fermentinės katalizės etapuose negali būti laikoma pasyvia substrato surišimo vieta. Tai sudėtinga molekulinė „mašina“, kuri naudoja įvairius cheminius mechanizmus substratui paversti produktu.
Fermento aktyviojoje vietoje substratai išsidėsto taip, kad reakcijoje dalyvaujančių substratų funkcinės grupės būtų labai arti viena kitos. Ši aktyvaus centro savybė vadinama reagentų konvergencijos ir orientacijos efektu. Dėl tokio tvarkingo substratų išdėstymo sumažėja entropija ir dėl to sumažėja aktyvacijos energija (Ea), kuri lemia fermentų katalizinį efektyvumą.
Aktyvus fermento centras taip pat prisideda prie tarpatominių ryšių destabilizavimo substrato molekulėje, o tai palengvina cheminės reakcijos atsiradimą ir produktų susidarymą. Ši aktyviosios vietos savybė vadinama substrato deformacijos efektu.
Iš knygos „Naujasis gyvenimo mokslas“. autorius Šeldraikas Rupertas2.2. Mechanizmas Šiuolaikinė mechaninė morfogenezės teorija pagrindinį vaidmenį priskiria DNR dėl šių keturių priežasčių. Pirma, buvo nustatyta, kad daugelis paveldimų skirtumų tarp tam tikros rūšies gyvūnų ar augalų priklauso nuo genų, kurie
Iš knygos Žmonių rasė pateikė Barnett AnthonyNervų sistemos veikimo mechanizmas Dabar tikriausiai verta atidžiau pažvelgti į šios sudėtingos struktūros veikimo mechanizmą, pradedant nuo paprasto pavyzdžio. Jei į akis apšviesite ryškią šviesą, jūsų vyzdys susiaurės. Ši reakcija priklauso nuo daugybės įvykių, kurie prasideda
Iš knygos „Avarijos istorija“ [arba „Žmogaus kilmė“] autorius Višniackis Leonidas Borisovičius Iš knygos Kelionė į mikrobų šalį autorius Betina VladimirasMikrobai yra fermentų gamintojai.Jau žinome, kad fermentai yra biologiniai katalizatoriai, tai yra medžiagos, palengvinančios daugelio cheminių reakcijų, vykstančių gyvoje ląstelėje, įgyvendinimą ir būtinos maistinėms medžiagoms gauti bei jai sukurti.
Iš knygos Embrionai, genai ir evoliucija pateikė Raffas Rudolfas AHeterochronija yra klasikinis evoliucinių pokyčių mechanizmas.Bandymai surasti evoliucijos mechanizmus, kurių šaknys yra ontogenezė, daugiausia orientuoti į heterochroniją – santykinio vystymosi procesų laiko pokyčius. Haeckelis pabrėžė priklausomybę
Iš knygos Natūralios biologinių sistemų technologijos autorius Ugolevas Aleksandras Michailovičius2.2. Bendrosios virškinimo fermentų charakteristikos Pažymėtina esminis fermentų sistemų, kurios atlieka virškinimą skirtinguose organizmuose, panašumas ir kartais stulbinantis sutapimas. Todėl charakteristikos, kurios bus pateiktos žemiau
Iš knygos „Dievo paslaptis ir smegenų mokslas“ [Tikėjimo ir religinės patirties neurobiologija] pateikė Andrew Newbergas2. Smegenų aparatas. Suvokimo mechanizmas
Iš knygos „Fenetika“ [Evoliucija, populiacija, bruožas] autorius Jablokovas Aleksejus VladimirovičiusI skyrius. Evoliucijos mechanizmas Pagrindinis strateginis biologijos, kaip mokslinės disciplinos, uždavinys – suprasti gyvybės raidos dėsnius, siekiant juos valdyti žmogaus interesais. Dešimtajame dešimtmetyje N. I. Vavilovas iškėlė mokslininkams perėjimo prie kontroliuojamos evoliucijos problemą -
Iš knygos O kas, jei Lamarkas teisus? Imunogenetika ir evoliucija pateikė Steele EdwardEvoliucinių jėgų sąveika – evoliucijos mechanizmas Evoliucijos trigerinis mechanizmas veikia dėl bendro evoliucinių veiksnių veikimo populiacijoje kaip evoliuciniame vienete. Kiekviena kiekvienos rūšies populiacija patiria vienokį ar kitokį spaudimą.
Iš knygos Lyties paslaptys [Vyras ir moteris evoliucijos veidrodyje] autorius Butovskaja Marina Lvovna Iš knygos Biologinė chemija autorius Lelevičius Vladimiras ValerjanovičiusDozės kompensavimo mechanizmas Daugumos žinduolių (bet ne marsupialų) viena iš X chromosomų yra inaktyvuota patelių somatinėse ląstelėse. Toks išjungimas yra vienas iš problemų sprendimo būdų rūšims, kurioms viena lytis atstovaujama dviem
Iš autorės knygos3 skyrius. Fermentai. Fermentų veikimo mechanizmas Fermentai arba fermentai – tai specifiniai baltymai, kurie yra visų gyvų organizmų ląstelių ir audinių dalis ir veikia kaip biologiniai katalizatoriai.Bendrosios fermentų ir neorganinių katalizatorių savybės:1. Ne
Iš autorės knygosFermento molekulės struktūra Pagal savo struktūrą fermentai gali būti paprasti arba sudėtingi baltymai. Fermentas, kuris yra sudėtingas baltymas, vadinamas holofermentu. Baltyminė fermento dalis vadinama apofermentu, nebaltyminė – kofaktoriumi. Yra dviejų tipų kofaktoriai: 1.
Iš autorės knygosFermentų veikimo specifiškumas Fermentai turi didesnį veikimo specifiškumą lyginant su neorganiniais katalizatoriais. Skiriamas specifiškumas, susijęs su fermento katalizuojamos cheminės reakcijos tipu, ir specifiškumas, susijęs su
Iš autorės knygos4 skyrius. Fermentų aktyvumo reguliavimas. Medicininė fermentologija Fermentų aktyvumo reguliavimo metodai: 1. Fermentų kiekio pokytis.2. Fermento katalizinio efektyvumo pokytis.3. Reakcijos sąlygų keitimas Kiekio reguliavimas
Iš autorės knygosFermentų panaudojimas medicinoje Fermentų preparatai plačiai naudojami medicinoje. Fermentai medicinos praktikoje naudojami kaip diagnostinės (enzimodiagnostikos) ir terapinės (enzimoterapijos) priemonės. Be to, fermentai naudojami kaip
Įvadas
Fermentai, arba fermentai (iš lot. fermentum, graik. ζύμη, ἔνζυμον – raugas) dažniausiai yra baltymų molekulės arba RNR molekulės (ribozimai) arba jų kompleksai, greitinantys (katalizuojantys) chemines reakcijas gyvose sistemose. Reagentai fermentų katalizuojamoje reakcijoje vadinami substratais, o susidariusios medžiagos – produktais. Fermentai yra specifiniai substratui (ATPazė katalizuoja tik ATP skilimą, o fosforilazės kinazė fosforilina tik fosforilazę).
Fermentų aktyvumą galima reguliuoti aktyvatoriais ir inhibitoriais (aktyvatorių daugėja, inhibitorių mažėja).
Baltymų fermentai sintetinami ribosomose, o RNR – branduolyje.
Terminai „fermentas“ ir „fermentas“ jau seniai vartojami kaip sinonimai (pirmasis daugiausia rusų ir vokiečių mokslinėje literatūroje, antrasis – anglų ir prancūzų kalbomis).
Mokslas apie fermentus vadinamas fermentologija, o ne fermentologija (kad nesupainiotume lotyniškų ir graikiškų žodžių šaknų).
Fermentų veikimo mechanizmas
Fermentų struktūra ir funkcijos bei veikimo mechanizmas beveik kasmet išsamiai aptariami daugelyje tarptautinių simpoziumų ir kongresų. Svarbi vieta skirta visos fermento molekulės ir jos aktyviųjų centrų sandarai, įvairių fermentų tipų molekuliniam veikimo mechanizmui, bendrai fermentinės katalizės teorijai. Nepaisant to, vis dar nėra visiško aiškumo dėl dviejų pagrindinių fermentologijos problemų: kas lemia fermentų veikimo specifiškumą ir aukštą katalizinį efektyvumą?
Prieš nustatant fermentų cheminę prigimtį, hipotezės apie jų veikimo mechanizmą buvo pagrįstos kinetiniais tyrimais ir cheminės homogeninės katalizės modelių eksperimentais. Cheminių reakcijų greičio padidėjimas veikiant fermentams buvo paaiškintas taip: a) substrato aktyvacija dėl adsorbcijos arba molekulinių, grįžtamai disocijuojamų fermentų-substratų kompleksų susidarymo; b) grandininės reakcijos mechanizmas, kuriame dalyvauja radikalai arba sužadintos molekulės. Paaiškėjo, kad grandininės reakcijos mechanizmai nevaidina reikšmingo vaidmens biologinėje katalizėje. Nustačius fermentų cheminę prigimtį, pasitvirtino daugiau nei prieš 80 metų V. Henri, L. Michaelis ir M. Menten iškelta mintis, kad fermentinės katalizės metu fermentas E susijungia (iš esmės grįžtamai) su jo substratu S, sudarydamas nestabilus tarpinis fermentas – substrato kompleksas ES, kuris reakcijos pabaigoje suyra, išsiskiriant fermentui ir reakcijos produktams P. Dėl didelio jungimosi afiniteto ir ES komplekso susidarymo į reakciją patenka substrato molekulių skaičius. smarkiai didėja. Šios idėjos sudarė E. Fisherio „raktų užrakto“ teorijos, kuri kartais vadinama „standžiosios matricos“ teorija, pagrindą. Taigi, standi aktyvaus centro struktūra papildo substrato molekulinę struktūrą ir taip užtikrina aukštą fermento specifiškumą.
L. Michaelis ne tik postulavo tarpinio fermento-substrato ES komplekso susidarymą, bet ir apskaičiavo substrato koncentracijos įtaką reakcijos greičiui. Reakcijos procese yra keli etapai: substrato molekulės pridėjimas prie fermento, pirminės tarpinės medžiagos pavertimas vienu ar daugiau nuoseklių (pereinamųjų) kompleksų ir galutinių reakcijos produktų atskyrimas nuo fermento, kuris įvyksta vienas ar keli etapai. Tai galima schematiškai iliustruoti šiais pavyzdžiais:
Fermentas sąveikauja su substratu labai trumpai, todėl ilgą laiką nebuvo įmanoma įrodyti tokio komplekso susidarymo. Tiesioginiai fermento-substrato komplekso egzistavimo įrodymai buvo gauti D. Keilin ir B. Chance laboratorijose. Šiuo metu eksperimentiniai ir matematiniai kinetikos, termodinamikos ir cheminių reakcijų statinės mechanikos metodai leidžia nustatyti daugelio fermentinių reakcijų kinetinius ir termodinaminius parametrus, ypač tarpinių fermento ir substrato kompleksų disociacijos konstantas, greitį ir pusiausvyros konstantas. jų formavimas.
Fermentų ir substratų kompleksų susidarymas apima vandenilinius ryšius, elektrostatinę ir hidrofobinę sąveiką, o kai kuriais atvejais ir kovalentinius bei koordinacinius ryšius. Informaciją apie jungčių tarp substrato ir aktyvaus fermento centro surišimo vietos pobūdį galima gauti EPR ir BMR metodais, taip pat UV ir IR spektroskopija.
Kataliziniam fermento aktyvumui būtina erdvinė struktūra, kurioje standžios α-spiralių atkarpos kaitaliojasi su lanksčiais, elastingais linijiniais segmentais, užtikrinančiais dinaminius fermento baltymo molekulės pokyčius. Šie pokyčiai yra labai svarbūs kai kuriose fermentinės katalizės teorijose. Taigi, priešingai nei E. Fisher "rakto užrakto" modelis, D. Koshland sukūrė "indukuoto atitikimo" teoriją, kuri leidžia užtikrinti didelį baltymo-fermento molekulės konformacinį labilumą ir aktyvaus centro lankstumą bei mobilumą. Ši teorija buvo pagrįsta labai įtikinamais eksperimentais, rodančiais, kad substratas sukelia konformacinius fermento molekulės pokyčius taip, kad aktyvi vieta įgauna erdvinę orientaciją, būtiną substratui surišti. Kitaip tariant, fermentas bus tik esant (tiksliau, prisitvirtinimo momentu) substratui aktyvioje (įtemptoje) T formoje, priešingai nei neaktyvioje R formoje (1 pav.).
Ryžiai. 1. Substrato sukelti fermento aktyvaus centro struktūros pokyčiai, pagal D. Koshland „indukuoto atitikimo“ modelį.
A, B, C - aktyviosios vietos funkcinės grupės; 1 - aktyvus kompleksas;
2 - neaktyvus kompleksas.
Fig. 1 parodyta, kad substrato S pridėjimas prie fermento E, sukeliantis atitinkamus aktyvaus centro konformacijos pokyčius, kai kuriais atvejais sukelia aktyvaus komplekso susidarymą, kitais - neaktyvų kompleksą dėl erdvinio išsidėstymo pažeidimo. aktyvaus centro funkcines grupes tarpiniame komplekse. Buvo gauti eksperimentiniai įrodymai naujai pozicijai, kad D. Koshlando postuluota „sukelta atitiktis“ tarp substrato ir fermento atsiranda nebūtinai dėl baltymo molekulės konformacijos pokyčių, bet ir dėl geometrinių bei elektronų topografinių persitvarkymų. substrato molekulės.
Kataliziniame procese būtinas tikslus fermento ir substrato atitikimas, taip pat termodinaminiai ir kataliziniai tokio atitikimo pranašumai. „Sukeltos atitikties“ hipotezė daro prielaidą, kad tarp fermento ir substrato egzistuoja ne tik erdvinis ar geometrinis komplementarumas, bet ir elektrostatinis atitikimas dėl priešingai įkrautų substrato grupių ir aktyvaus fermento centro poravimosi. Tikslus atitikimas užtikrina veiksmingo substrato ir fermento komplekso susidarymą.
Kaip ir kiti katalizatoriai, termodinaminiu požiūriu fermentai pagreitina chemines reakcijas, sumažindami aktyvacijos energiją. Aktyvinimo energija yra energija, reikalinga tam tikroje temperatūroje visoms medžiagos molio molekulėms paversti aktyvuota būsena. Kitaip tariant, tai energija, reikalinga cheminei reakcijai pradėti, be kurios reakcija neprasideda, nepaisant jos termodinaminės tikimybės. Fermentas sumažina aktyvacijos energiją padidindamas aktyvuotų molekulių skaičių, kurios tampa reaktyvios esant žemesniam energijos lygiui (2 pav.).
Ryžiai. 2. Fermentinių ir nefermentinių cheminių reakcijų energetinis mechanizmas.
S - pradinis substratas; P - produktas; ΔENF - nefermentinės reakcijos aktyvavimo energija; ΔEF – fermentinės reakcijos aktyvavimo energija; ΔG yra standartinis laisvosios energijos pokytis.
Paveikslėlyje parodyta, kad fermentinės reakcijos aktyvinimo energija yra mažesnė. Reikėtų pažymėti, kad tiek fermentų katalizuojamų, tiek ne fermentų katalizuojamų reakcijų, nepaisant jų kelio, standartinio laisvosios energijos pokyčio (ΔG) dydis yra toks pat. Veikdami reakcijos greitį, fermentai nekeičia pusiausvyros tarp tiesioginės ir atvirkštinės reakcijos, taip pat neįtakoja laisvosios reakcijos energijos; jie tik pagreitina cheminės reakcijos pusiausvyros atsiradimą.
Ryšys tarp pusiausvyros konstantos ir reaguojančių medžiagų laisvosios energijos kitimo dažniausiai matematiškai išreiškiamas lygtimi ΔG = = –R T lnK, kur R – dujų konstanta; T – absoliuti temperatūra Kelvinais; lnК – pusiausvyros konstantos natūralusis logaritmas; ΔG – standartinis laisvosios energijos pokytis, J/mol. Iš pateiktos lygties matyti, kad esant didelei K reikšmei, ΔG reikšmė pasirodo esanti neigiama. Tokias reakcijas lydi laisvosios energijos sumažėjimas. Esant mažai K reikšmei, ΔG reikšmė yra teigiama. Jei pusiausvyros konstanta lygi vienybei, tai laisvosios energijos pokytis bus lygus nuliui ir reakcija lengvai grįžtama.
Norint išmatuoti cheminės reakcijos pusiausvyros konstantą ir laisvosios energijos vertę, pvz., fermento fosfogliukomutazės katalizuojamą gliukozės-1-fosfato pavertimą gliukoze-6-fosfatu, nustatykite gliukozės-6- ir gliukozės-1- kiekį. fosfatas, kai pasiekiama cheminė pusiausvyra. Esant pusiausvyrai, gliukozės-6-fosfato kiekis yra 19 kartų didesnis nei gliukozės-1-fosfato kiekis. Vadinasi, pusiausvyros konstanta K lygi 19. Pakeitę šį skaičių į lygtį, gauname ΔG = –7329 J/mol. Tai reiškia, kad 1 moliui gliukozės-1-fosfato pavertus 1 molį gliukozės-6-fosfato 25°C temperatūroje, sistemos laisva energija sumažėja 7329 J.
Taigi fermentinės katalizės mechanizme pagrindinį vaidmenį atlieka tarpiniai fermento-substrato kompleksai, kurių susidarymą lemia tiek smulki trimatė aktyviojo centro struktūra, tiek unikali visos fermento molekulės struktūrinė organizacija. užtikrina aukštą katalizinį aktyvumą ir biokatalizatoriaus veikimo specifiškumą.
