Mikrobiologie aglutinační reakce. Aglutinační reakce (RA)

Přednáška č. 16

Slovník

PŘÍMO - rovnou další bez ničeho, bez následných odkazů.

NEPŘÍMO– prostřednictvím jiných buněk, nikoli přímo.

SNÍŽENÍ ≠ ZVÝŠENÍ (aktivita buněk).

ODMÍTNOUT – nepřijmout, odmítnout. Tělo transplantovaný orgán odmítá.

Imunitní reakce.

Imunitní reakce jsou reakce specifické interakce (vazby) antigenu a protilátky nebo antigenu a senzibilizovaného T-lymfocytu.

Tyto reakce probíhají in vitro (ve zkumavce) a in vivo (v živém organismu).

Tyto reakce zahrnují sérum (sérum), proto se nazývají sérologické.

Imunitní reakce jsou zvyklé diagnostika infekčních chorob. V tomto případě je neznámá složka určena známou složkou, která je založena na specifičnosti interakce antigenu s protilátkou. Li známá protilátka, potom můžeš identifikovat (objevit) neznámý antigen. Li známý antigen, pak jej můžete použít detekovat neznámé protilátky.

Používají se tedy imunitní reakce:

1) pro sérologické diagnostiky(sérodiagnostika) nemocí - průkaz v krevním séru nemocných osob protilátek proti konkrétnímu původci infekčního onemocnění (známý antigen); pokud jsou v krevním séru nemocné osoby přítomny protilátky proti jakémukoli patogenu, pak je to tento patogen, který způsobil toto infekční onemocnění;

2) pro sérologická identifikace (seroidentifikace) mikrobů - k určení typu patogenu pomocí imunitních diagnostických sér (známé protilátky); pokud se protilátky navážou na patogen izolovaný od nemocné osoby, pak je tento mikrob identický s mikrobem, kterým bylo zvíře imunizováno přijímání imunitní diagnostické sérum .

Imunitní reakce probíhají ve 2 fázích:

1) specifická fáze– spojení aktivního centra protilátky s determinantní skupinou antigenu za vzniku komplexů antigen-protilátka; tato fáze probíhá rychle, ale není viditelný účinek;

2) nespecifická fáze– vzhled viditelný efekt interakce antigenu a protilátky - ztráta návrh(aglutinace) popř oblačnost(srážky), což umožňuje vidět vzdělání komplexy antigen-protilátka a vyvodit závěr o dodržování antigen a protilátka navzájem.

Imunitní reakce zahrnují aglutinační reakce (RA), precipitační reakce (RP), reakce fixace komplementu (CFR).

Aglutinační reakce- jedná se o slepení a precipitaci mikrobiálních nebo jiných buněk (erytrocytů) vlivem protilátek za přítomnosti elektrolytu. Viditelným efektem reakce (aglutinační fenomén) je vznik sraženiny tzv aglutinovat.

Tato reakce se používá pro sérodiagnostika A séroidentifikace. RA se používá pro sérodiagnostiku (detekce protilátek v krevním séru pacientů) břišní tyfus a paratyfus(Vidální reakce), brucelóza(Wrightova reakce) tularémie a leptospirózy. RA se používá k séroidentifikaci (určení typu patogenu izolovaného z pacienta), když střevní infekce, černý kašel, cholera atd.

Komponentyreakce:

1. A ntigen (aglutinogen) – jedná se o celé (ne zničené) mikrobiální nebo jiné buňky ( korpuskulární, nerozpustný antigen). Aglutinogeny- toto je pozastavení naživu nebo zabil mikrobiální buňky nebo jakékoli jiné buňky. Antigeny mohou být neznámé nebo známé. Neznámý aglutinogen je mikrobiální kultura izolovaná z těla pacienta, kterou je třeba určit. Známý antigen - diagnosticum- diagnostický lék - suspendování mrtvých mikroby známé druhy ve fyziologickém roztoku. Toto pozastavení zataženo (neprůhledné), protože mikrobiální buňky se nerozpustí, ale zůstanou neporušené. Známý aglutinogen bude použit k detekci neznámých protilátek v krevním séru pacientů.

2. Protilátka (aglutinin)– nachází se v krevním séru. Protilátky mohou být také neznámé nebo známé. Neznámé protilátky, které mají být stanoveny, jsou v krevním séru nemocný člověk. Známé protilátky se nacházejí v imunitní diagnostická séra které se nazývají aglutinační séra. Používají se pro séroidentifikaci, tzn. k určení neznámého antigenu – typu mikrobiální kultury.

3. Elektrolyt– 0,9% roztok chloridu sodného.

Získání diagnostického testu.

Čistá kultura patogenu známého druhu (například původce břišního tyfu) pěstovaná na šikmém agaru se smyje 3–4 ml izotonický roztok, umístěné ve sterilní zkumavce, nějakým způsobem usmrtit mikroby (např. varem a určit hustotu (v 1 ml by měly být 3 miliardy mikrobiálních buněk). Pokud jsou mikrobiální buňky usmrceny vysoká teplota, pak dostanou O-diagnosticum (O-antigen), ale pokud je ošetřen formaldehydem, pak dostanou H-diagnosticum (H-antigen).

Příklady diagnostiky: salmonella diagnosticum, brucellosis diagnosticum, tularemia diagnosticum.

Příprava aglutinačních sér.

Zvířatům (obvykle králíkům) jsou parenterálně injikovány mikrobiální diagnostická léčiva ve zvyšujících se dávkách 5–7krát v intervalech ( provést hyperimunizaci) a následně je jim odebráno krevní sérum, které obsahuje protilátky proti mikrobům, ze kterých se diagnosticum připravuje. Pokud se imunizace provádí pomocí O-diagnosticum, pak se získají O-aglutinační séra (obsahují O-protilátky), pokud s H-diagnosticem, získají se H-aglutinační séra.

Aglutinační séra mohou být neadsorbovaný nebo nativní a adsorbované.

Neadsorbovaná séra obsahují skupinové protilátky proti několika blízce příbuzným druhům mikrobů.

Adsorbovaná séra obsahují protilátky proti jednomu nebo více antigenům jednoho typu mikrobu. Pokud séra obsahují protilátky pouze proti jednomu antigenu, jsou tzv monoreceptor nebo jednomocný, pokud na několik antigenů – skupina adsorbovaná séra .

Příklady aglutinačních sér:Salmonella monoreceptor H-aglutinační sérum, Salmonella skupina adsorbované O-aglutinační sérum, anticholerové O-aglutinační sérum atd..

Titr aglutinační sérum - nejvyšší ředění séra, při kterém je ještě detekována aglutinační reakce s antigenem (titr závisí na množství protilátek v krvi: čím více protilátek, tím vyšší titr séra).

Metody stagingu RA.

1. Přibližná (lamelární) RA– provádí se na skle. Na podložní sklíčko naneste 2 kapky séra a 1 kapku izotonického roztoku. Mikrobiální kultura se přidá ve smyčce do jedné z kapek séra a do kapky izotonického roztoku a promíchá se. Kapka izotonického roztoku s choroboplodnými zárodky – kontrola antigenu, kapka bezmikrobní séra – kontrola protilátek, kapka séra s mikroby – Zkušenosti. Pokud sérum obsahuje protilátky odpovídající mikrobiálním antigenům, které se s ním mísí, pak se protilátky a antigeny na sebe specificky navážou a po 1–3 minutách se v testovací kapce objeví aglutinační vločky. Antigenová kontrola by měla být zakalená a protilátková kontrola by měla být čirá. Výsledky reakce se zaznamenávají na základě výskytu aglutinátových vloček . Pokud vločky vypadnou, je reakce pozitivní, tzn. Antigen odpovídá protilátce a antigen lze použít ke stanovení protilátky nebo naopak. Pokud zákal zůstane, reakce je negativní.

2. Detailní aglutinační reakce - prováděné ve zkumavkách. Nejprve připravte 2-násobné ředění krevního séra nemocného člověka od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného se nalije do 6 zkumavek. Do první zkumavky se přidá 1 ml pacientova krevního séra v ředění 1:50, promíchá se a získá se ředění 1:100, poté se přenese 1 ml v ředění 1:100 do druhé zkumavky a získá se ředění 1:200 atd. Dvě zkumavky jsou uchovávány pro kontrolu antigenu a séra. Ke kontrole séra přidejte pouze sérum v ředění 1:50, ke kontrole antigenu - pouze antigen. Do všech ostatních zkumavek přidejte 0,1 ml antigenu - diagnosticum (O- nebo H-) a vložte všechny zkumavky do termostatu při 37°C na 18-20 hodin. Výsledky reakce se zaznamenávají podle povahy, množství vzniklé sraženiny (aglutinátu) a stupně zákalu. Zaúčtování se provádí pouze s následujícími výsledky v kontrolách: kontrola séra - průhledná, kontrola antigenu - zakalená. O-protilátky poskytují jemnozrnnou sraženinu. H-protilátky – hrubozrnné. Na základě poslední zkumavky, ve které je ještě patrná aglutinační reakce, se stanoví diagnostický titr.

Během sérodiagnostiky onemocnění, je důležité nejen detekovat specifické protilátky proti konkrétnímu patogenu, ale také identifikovat jejich množství, tzn. stanovit takový titr protilátek Kdy můžeme mluvit o přítomnosti onemocnění způsobeného tímto patogenem? . Tento titr se nazývá diagnostický titr. Chcete-li například diagnostikovat břišní tyfus, musíte určit titr protilátek 1:400, ale ne méně. Ještě více přesné výsledky dává detekce zvýšení protilátek v párových sérech. Sérum pacienta se odebírá na počátku onemocnění a po 3 až 5 i více dnech. Pokud se titr protilátek zvýší alespoň 4krát, můžeme tedy mluvit o aktuální nemoc.

Pokud se pro séroidentifikaci provádí podrobná aglutinační reakce, pak se použijí aglutinační diagnostická séra naředěná na titr nebo na polovinu jejich titru. RA je považována za pozitivní, pokud je aglutinace detekována při ředění blízkém titru diagnostického séra.

v mikrobiologii

"Aglutinační reakce a její typy (RA)"

Plán:

1. Úvod………………………………………………………………………………………..3

2. RA na skle………………………………………………………………………………..4

3. Zkumavka RA……………………………………………………………………………………………….5

4. Použitá literatura………………………………………………………………………..7

1. Úvod.

Interakce mikrobiálního antigenu a protilátek je přísně specifické povahy a je zaměřena v těle zvířete na neutralizaci patogenu a jeho toxinů. Interakce antigenu a protilátek in vitro je za určitých podmínek provázena viditelnými jevy (aglutinace, precipitace, imunitní lýza), což umožňuje využití AG-AT reakcí, nazývaných sérologické (z latinského sérum), pro praktické účely. Biotovárny produkují antigeny a imunitní séra (protilátky) známé specifické povahy (diagnostické). Pomocí takových sér v sérologických reakcích je možné identifikovat neznámý mikroorganismus nebo pomocí známého antigenu detekovat v těle protilátky syntetizované v reakci na zavlečení patogenu, a tak stanovit diagnózu (sérologickou diagnózu). Kromě toho lze sérologické reakce použít k posouzení intenzity imunitní odpovědi po očkování nebo infekčním onemocnění.

Aglutinační reakce, jako je nepřímá aglutinace a Coombs, jsou založeny na in vitro interakci korpuskulárních antigenů s protilátkami a schopnosti výsledných komplexů precipitovat. Jako korpuskulární antigeny se používají bakteriální buňky nebo rozpustné antigeny extrahované z mikroorganismů a sorbované na nosných tělíscích: červené krvinky, latexové částice atd.

Antigenní determinanty korpuskulárních antigenů specificky interagují s homologními protilátkami (specifická, neviditelná fáze reakce), a pak komplexy antigen-protilátka tvoří velké konglomeráty viditelné pouhým okem, které se vysrážejí - aglutinát (nespecifická, viditelná fáze reakce). ). Formy mikrobů bez bičíkatých (Brucellae) produkují granulované aglutinanty, zatímco bičíkaté formy (Escherichia, Salmonella) produkují velké bavlněné aglutinanty, které se usazují na dně zkumavky ve formě obráceného deštníku a při zatřesení se snadno rozbijí. Antigeny a protilátky interagují pouze v přítomnosti elektrolytu (0,8% roztok chloridu sodného). Průběh reakce je ovlivněn koncentrací soli v elektrolytu, počtem mikrobiálních buněk v suspenzi, koncentrací v séru, pH, teplotou a dalšími faktory.

Aglutinační reakce (ra).

Dochází ke specifické aglutinaci, která je založena na interakci antigenu S homologní protilátka , obsažené v těle zvířete, do kterého byl tento antigen zaveden (imunoaglutinace); nespecifické (chemické), vznikající změnami pH prostředí, koncentrací elektrolytů; spontánní, což je pozorováno, když jsou bakterie (v R-formě) suspendovány ve fyziologickém roztoku a při zahřívání, což je spojeno se změnou koloidního stavu bakteriální buňky. Antigen , zapojený do RA se nazývá aglutinogen, protilátka se nazývá aglutinin a výsledná sraženina se nazývá aglutinát. Při tvorbě aglutinátu je důležitý kvantitativní poměr antigenu a protilátek (optimální jev). Při přebytku nebo nedostatku protilátek dochází ke zpoždění.

Aglutinační reakce (RA) je jednou z prvních imunologických reakcí používaných v mikrobiologické praxi. Poprvé (1895) použil F. Vidal RA k diagnostice břišního tyfu. Později (1897) použil A. Wright stejnou reakci k diagnostice brucelózy u lidí. RA také našla uplatnění v diagnostice pullorózy u kuřat, leptospirózy, infekčního potratu klisen a také při typizaci neznámých mikrobiálních kultur pomocí známého aglutinačního séra. RA je vysoce citlivá; lze jím detekovat 0,01 μg protilátkového proteinového dusíku v 1 ml.

Bylo vyvinuto několik variant aglutinační reakce, které se liší metodologickým provedením a účelem studie.

2. Ra na skle.

U této varianty RA mohou být testovanými subjekty buď sérum nebo antigen, ale nejčastěji se tato možnost používá k identifikaci mikroorganismů.

1. K identifikaci mikroorganismu (m/o) se kapka známého aglutinačního séra, například séra Salmonella, a kapka fyziologického roztoku (kontrola) aplikují odděleně na podložní sklíčko bez tuku. Poté se pomocí bakteriologické smyčky odebere bakteriální hmota studované kultury z kolonie v Petriho misce nebo z povrchu šikmé MPA ve zkumavce a odděleně se suspenduje v imunitním séru a fyziologickém roztoku, dokud nevznikne homogenní suspenze. získané. Výsledek se bere v úvahu po 2...4 minutách.

Zaúčtování výsledků: v kontrolním vzorku by neměly být žádné změny. Pokud se bakteriální kultura specificky shoduje s imunitním sérem, objeví se aglutinační vločky (pozitivní výsledek, pokud nedochází k aglutinačnímu jevu, dochází k závěru, že studovaná bakteriální kultura neodpovídá imunitnímu séru).

2. Uvažujme detekci anittelů v testovacím krevním séru na příkladu testu bengálské růže používaného v sérodiagnostice brucelózy. Na podložní sklíčko se nanese 0,3 ml krevního séra testovaného zvířete a 0,03 ml brucelózního antigenu (buňky brucelly obarvené růžovou barvou). Složky se důkladně promíchají protřepáním sklenice a výsledek se vezme v úvahu po 4 minutách.

Záznam výsledků: pokud je reakce pozitivní, objeví se růžové vločky aglutinátu. Sérologická reakce tohoto typu je klasifikována jako kvalitativní, protože může být použita k detekci protilátek proti patogenu v krevním séru zvířete, ale není možné posoudit jejich kvantitativní obsah.

/ 50
Nejhorší Nejlepší

Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.

Podle typu použitého imunodiagnostika se rozlišují reakce mikrobiální aglutinace, hemaglutinace, latexové aglutinace, koagulace atd.

Pro diagnostiku infekčních onemocnění se aglutinační reakce provádí dvěma směry: pomocí diagnostického aglutinačního séra (sérologická identifikace mikroba) se určí typ patogenního mikroba izolovaného od pacienta a pomocí standardního mikrobiálního séra se detekují specifické protilátky v séru pacienta. diagnosticum (sérodiagnostika onemocnění, sérologická diagnóza).

Existují přímé a nepřímé aglutinační reakce

Přímá mikrobiální aglutinační reakce (RA). Při této reakci protilátky (aglutininy) přímo aglutinují korpuskulární antigeny (aglutanogeny). Obvykle jsou představovány suspenzí inaktivovaných mikroorganismů (mikrobiální aglutinační reakce). Na základě povahy vytvořeného aglutinátu se rozlišuje granulární a flokulentní aglutinace. Ke granulární aglutinaci dochází, když se mikroby obsahující O-antigen slepí. Bakterie s bičíky (H-antigen) aglutinují za vzniku velkých vloček.

K určení typu mikroorganismů se používají standardní diagnostická aglutinační séra. Získávají se hyperimunizací laboratorních zvířat suspenzí bakterií. Titr takového séra je jeho nejvyšším ředěním, při kterém je pozorována jasná aglutinace odpovídajícího antigenu. Vzhledem ke složitosti antigenní struktury bakterií však aglutinační séra obsahují protilátky nejen proti druhově specifickým, ale i proti skupinovým antigenům a mohou způsobit skupinovou aglutinaci s příbuznými druhy bakterií. Titry protilátek vůči druhově specifickým antigenům v séru jsou vždy vyšší než vůči skupinovým antigenům. K odstranění skupinově specifických protilátek se do séra postupně přidávají mikroorganismy obsahující skupinové antigeny (metoda Castellani). Tato metoda produkuje adsorbovaná séra, která obsahují protilátky proti specifickému typu mikrobů.

Metody aglutinační reakce. Nejběžnější jsou lamelární (přibližné) a rozšířené RA. Deska RA je umístěna na skle. Při této reakci se používají mírně naředěná nebo neředěná séra. Používá se jako zrychlená metoda pro detekci protilátek nebo identifikaci mikroorganismů. Na sklenici se nanese kapka séra, do které se kličkou zavede neznámá bakteriální kultura, promíchá se a po 2-3 minutách je pozorován vzhled jemnozrnné nebo vločkovité aglutinace. Pro kontrolu se používá kapka fyziologického roztoku, u kterého je po přidání bakterií pozorován zákal. Při použití neadsorbovaných sér je reakce na skle pouze orientační.

Expandovaná RA se provádí ve zkumavkách nebo destičkách. V tomto případě se diagnostické sérum naředí na titr a přidá se stejná množství antigenu. Pokud je výsledek pozitivní, vytvoří se na dně zkumavky sypký sediment ve formě „deštníku“, pokud je výsledek negativní, vytvoří se sediment ve formě „knoflíku“. Protože titry skupinově specifických protilátek v séru jsou mnohem nižší než titry druhově specifických protilátek, jsou skupinové reakce pozorovány pouze v malých ředěních séra. Pokud dojde k aglutinaci před titrem nebo do poloviny titru séra, je to druhově specifické.

Pro stanovení protilátek v séru pacienta (sérologická diagnostika) se používá standardní mikrobiální diagnosticum obsahující suspenzi známých mikrobů nebo jejich antigenů. V tomto případě je také možné instalovat desku a nasazenou RA.

Přímá aglutinační reakce buněk. Pro stanovení krevních skupin se používají standardní krevní séra dárců obsahující známé protilátky anti-A nebo anti-B. Reakce se provádějí na skle nebo deskách. Pokud mají erytrocyty A (2. krevní skupina), B (3. krevní skupina) nebo oba antigeny (4. krevní skupina), příslušná séra aglutinují erytrocyty. Používá se také test krevní kompatibility, kdy se smíchají kapky krve od dárce a příjemce a posoudí se aglutinace.

Kliniky využívají aglutinační reakci leukocytů, krevních destiček a dalších buněk k identifikaci autoprotilátek a také ke stanovení antigenů na těchto buňkách.

Nepřímá (pasivní) aglutinační reakce. Pro získání fenoménu aglutinace je antigen předem adsorbován na korpuskulárním nosiči, kterým jsou inertní částice (latex, celulóza, polystyren, oxid barnatý atd.) nebo buňky (ovčí červené krvinky, lidská krevní skupina I(0) ).

Při pasivní hemaglutinační reakci (RPHA) se jako nosič používají červené krvinky. Antigenem nabité červené krvinky se slepí pohromadě v přítomnosti specifických protilátek proti tomuto antigenu a vysrážejí se. Antigenem senzibilizované erytrocyty se v RPGA používají jako erytrocytární antigenní diagnosticum pro průkaz protilátek (sérodiagnostika, sérologická diagnostika). Pokud jsou červené krvinky naplněny protilátkami, mohou být použity k detekci antigenů.

Přímé a nepřímé antiimunoglobulinové Coombsovy reakce. Používá se k detekci „nekompletních“ (neaglutinujících) protilátek, které se tvoří při různé nemoci: Rhesusův konflikt, autoimunitní onemocnění, některé infekce. K vyvolání těchto reakcí je zapotřebí antiglobulinové sérum, které se získá imunizací králíka lidskými imunoglobuliny. Toto sérum obsahuje kompletní (bivalentní) anti-imunoglobulinové protilátky.

Přímá reakce: k promytým červeným krvinkám pacienta se přidá antiimunoglobulinové sérum. Pokud jsou na červených krvinkách neúplné protilátky (imunoglobuliny), což je pozorováno s hemolytická anémie, Rhesus konflikt (fetální červené krvinky), pak dochází k jejich aglutinaci.

Nepřímá reakce odhalí volné antierytrocytární protilátky v krevním séru pacienta. K tomuto séru se přidají promyté erytrocyty od dárce krevní skupiny 0(I). Směs se inkubuje při 37 °C po dobu 30 minut a červené krvinky se promyjí. Poté se k nim přidá antiimunoglobulinové sérum. Pokud sérum pacienta mělo nekompletní protilátky proti erytrocytům, dojde k aglutinaci.

Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.

K provedení aglutinační reakce(RA) jsou zapotřebí tři složky: 1) antigen (aglutinogen);

2) protilátka (aglutinin)

3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).

Přibližná aglutinační reakce (RA)

Indikativní nebo destička RA se umístí na podložní sklíčko při pokojové teplotě. K tomu použijte Pasteurovu pipetu a naneste odděleně na sklenici kapku séra v ředění 1:10 až 1:20 a kontrolní kapku izotonického roztoku chloridu sodného. Do obou bakteriologických smyček se zavedou kolonie nebo denní kultura bakterií (kapka diagnostica) a důkladně se promísí. Reakce jsou zohledněny vizuálně po několika minutách, někdy pomocí lupy (x5). Při pozitivní RA je v kapce séra zaznamenán výskyt velkých a malých vloček, při negativní RA zůstává sérum rovnoměrně zakalené.

Rýže. 2. Přibližná aglutinační reakce.

Detailní aglutinační reakce za účelem identifikace titru specifických protilátek u pacienta.

Plně rozvinutá RA pro sérodiagnostiku se provádí v séru pacientů. Také se ředí v izotonickém roztoku chloridu sodného od 1:50 - 1:100 do 1:800 nebo 1:1600. Protože nižší sérové ​​titry mohou obsahovat normální aglutininy nalezené v zdravých lidí nebo pacientů s jinou diagnózou (diagnostický titr). Jako antigen v této reakci se používají diagnostická - známé suspenze, obvykle usmrcených bakterií.

Do aglutinačních zkumavek se nejprve nalije 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Do prvního z nich se přidá 1 ml séra zředěného 1:100 a po jeho promíchání se 1 ml přenese do druhého, z druhého na třetí atd. K výsledným dvojnásobným ředěním sér (od 1:100 do 1:1600 nebo více) se přidají 1-2 kapky bakteriální suspenze obsahující 3 miliardy mikrobiálních tělísek v 1 ml. Zkumavky se protřepou a umístí na 2 hodiny do termostatu při 37 °C, poté se udržují při teplotě místnosti po dobu 24 hodin.

Podrobná aglutinační reakce se zohledňuje postupným vyhodnocením každé zkumavky, počínaje kontrolními, za mírného protřepání. V kontrolních zkumavkách by neměla být žádná aglutinace. Intenzita aglutinační reakce je označena následujícími znaky: ++++ - úplná aglutinace (aglutinace vloček v absolutně průhledné kapalině); +++ - neúplná aglutinace (vločky v mírně opalescentní kapalině); ++ - částečná aglutinace (vločky jsou jasně viditelné, kapalina je mírně zakalená); + - slabá, pochybná aglutinace - kapalina je velmi zakalená, vločky v ní jsou těžko rozlišitelné; - - absence aglutinace (kapalina je rovnoměrně zakalená).

Za titr séra se považuje jeho poslední ředění, ve kterém je intenzita aglutinace hodnocena jako ne méně než dva plusy (++)

Rýže. 7. Detailní aglutinační reakce.

Nepřímá (pasivní) hemaglutinační reakce (IRHA, RPHA)

Reakce je dána:

1) pro detekci polysacharidů, proteinů, bakteriálních extraktů a dalších vysoce disperzních látek, rickettsie a virů, jejichž komplexy s aglutininy nelze u konvenčních RA pozorovat,

2) k detekci protilátek v séru pacientů proti těmto vysoce rozptýleným látkám a malým mikroorganismům.

Nepřímá neboli pasivní aglutinace je chápána jako reakce, při které protilátky interagují s antigeny předem adsorbovanými na inertních částicích (latex, celulóza, polystyren, oxid barnatý aj. nebo ovčí červené krvinky, I (0) - lidská krevní skupina)

Při pasivní hemaglutinační reakci (RPHA) červené krvinky. Antigenem nabité červené krvinky se slepí pohromadě v přítomnosti specifických protilátek proti tomuto antigenu a vysrážejí se. Antigenem senzibilizované erytrocyty se v RPGA používají jako erytrocytární diagnosticum pro průkaz protilátek (serodiagnostika). Pokud jsou červené krvinky nabity protilátkami (erytrocytární protilátka diagnosticum), lze jej použít k detekci antigenů.

Rýže. 3. Schéma RPGA: červené krvinky (1), naložené antigenem (3), jsou vázány specifickými protilátkami (4).

Inscenace. V jamkách polystyrénových destiček se připraví série sériových ředění séra. Do předposlední jamky přidejte 0,5 ml zjevně pozitivního séra a do poslední jamky 0,5 ml fyziologického roztoku (kontroly). Poté se do všech jamek přidá 0,1 ml zředěného erytrocytárního diagnostica, protřepe se a umístí na 2 hodiny do termostatu.

Účetnictví. V pozitivním případě se červené krvinky usazují na dně jamky ve formě rovnoměrné vrstvy buněk se složeným nebo zubatým okrajem (obrácený deštník v negativním případě se usazují ve formě knoflíku nebo kroužku); .

Obr.4. Účtování pro RNGA (RPGA).

Účtování výsledků RNGA provedených k detekci botulotoxinu.

Původce botulismu - Clostridium botulinum produkuje toxiny sedmi sérovarů (A, B, C, D, E, F, G), ale nejčastěji se vyskytují sérovary A, B, E Všechny toxiny se liší antigenními vlastnostmi a lze je odlišit v reakcích s použitím typově specifických sér . Za tímto účelem lze provést pasivní (nepřímou) hemaglutinační reakci se sérem pacienta, u kterého se předpokládá přítomnost toxinu, a červených krvinek naložených protilátkami antitoxických antibotulinových sér typu A, B, E. Normální sérum slouží jako kontrola.

Rýže. 3. Vyjádření a výsledek RNGA.

Účetnictví. V pozitivním případě se červené krvinky usazují na dně jamky ve formě rovnoměrné vrstvy buněk se složeným nebo zubatým okrajem (obrácený deštník v negativním případě se usazují ve formě knoflíku nebo kroužku); .

Závěr: V séru pacientky byl detekován botulotoxin typu E.

Hemaglutinační inhibiční reakce (HAI).

Rýže. 8. Hemaglutinační inhibiční reakce (HAI) (schéma).

Princip reakce je založen na schopnosti AT vázat různé viry a neutralizovat je, čímž znemožňuje aglutinaci červených krvinek. Vizuálně se tento efekt projevuje „inhibicí“ hemaglutinace. RTGA se používá v diagnostice virové infekce identifikovat specifické antihemaglutininy a identifikovat různé viry podle jejich hemaglutininů, které vykazují vlastnosti Ag.

Typizace viru se provádí v reakci RTGA se sadou typově specifických sér. Výsledky reakce jsou zohledněny nepřítomností hemaglutinace. Podtypy viru typu A s antigeny H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 a dalšími lze v RTGA diferencovat pomocí sady homologních typově specifických sér

Rýže. 9. Výsledky RTGA pro typizaci viru chřipky

Legenda: - inhibice hemaglutinace (tlačítko); - hemaglutinace (deštník).

Závěry: Studovaný materiál obsahuje virus chřipky typu A s antigenem H3N2

IMUNOMIKROBIOLOGICKÉ STUDIE

Imunologické metody se používají k řešení mnoha problémů:

1. Posouzení stavu imunitní systém osoba (imunitní stav) stanovením kvantitativní a funkční charakteristiky buňky imunitního systému a jejich produkty.

2. Stanovení složení a vlastností lidských tkání: krevní skupiny, Rh faktor, transplantační antigeny.

3. Diagnostika infekčních onemocnění a rezistence vůči nim detekcí a stanovením titrů protilátek (sérodiagnostika), identifikací antigenů patogenů v těle a stanovením buněčných reakcí na tyto antigeny.

4. Seroidní identifikace kultur bakterií a virů izolovaných z těla lidí a zvířat.

5. Detekce v lidském těle a ve vnějším prostředí jakýchkoli látek, které mají antigenní nebo haptenové vlastnosti (hormony, enzymy, jedy, léky, léky atd.).

6. Identifikace imunopatologických stavů, alergií, transplantačních a protinádorových reakcí.

Proces interakce mezi antigenem a protilátkou v sérologických reakcích probíhá ve dvou fázích:

1) charakteristický- fáze interakce, ve které dochází ke komplementární kombinaci aktivních center protilátek (paratopů) a epitopů antigenu. Tato fáze obvykle trvá několik sekund nebo minut;

2) nespecifické- fáze projevu, charakter vnější znaky tvorba imunitních komplexů. Tato fáze může trvat několik minut až několik hodin.

K optimální specifické interakci protilátek s antigenem dochází v izotonickém roztoku s pH blízkým neutrálnímu. Reakce antigen-protilátka v systému in vitro může být doprovázena výskytem několika jevů

· aglutinace,

· srážky,

· lýza.

Vnější projevy reakce závisí na fyzikální a chemické vlastnosti antigen (velikost částic, fyzický stav), třída a typ protilátek (kompletní a neúplné), stejně jako experimentální podmínky (konzistence média, koncentrace soli, pH, teplota).

Polyvalence antigenů a protilátek zajišťuje tvorbu agregátů viditelných pouhým okem. K tomu dochází v souladu s teorií tvorby sítě, podle níž jsou na výsledný komplex antigen-protilátka postupně připojeny další molekuly protilátky a antigenu. V důsledku toho se tvoří síťové struktury, které se mění v agregáty, které se vysrážejí. Povaha a závažnost reakce závisí na kvantitativním poměru antigenů a protilátek. Nejintenzivnější reakce nastávají, když jsou reagencie v ekvivalentních poměrech.

Předpoklad tvorba mřížky (sítě) - přítomnost více než tří antigenních determinant pro každou molekulu antigenu a dvou aktivních center pro každou molekulu protilátky. Molekuly antigenu jsou mřížkové uzly a molekuly protilátek jsou spojovací články. Oblast optimálních poměrů (zóna ekvivalence) koncentrací antigenu a protilátek, kdy po vytvoření sedimentu nejsou v supernatantu detekovány volné antigeny ani volné protilátky.

Agregáty, které se mohou vysrážet, se tvoří, když se antigeny spojí s plnými protilátkami. Nekompletní protilátky (monovalentní) nezpůsobují tvorbu síťových struktur a velkých agregátů. K detekci takových protilátek se používají speciální metody založené na použití antiglobulinů (Coombsova reakce).

Sérologické reakce se pro svou vysokou specificitu a senzitivitu používají k průkazu a kvantifikaci antigenů a protilátek. Množství imunoreagentů v reakcích je vyjádřeno titrem - maximálním ředěním séra nebo antigenu, při kterém je ještě pozorována reakce.

Sérologické reakce v mikrobiologických a imunologických laboratořích se používají ke dvěma účelům:

1) pro séroidentifikaci mikroorganismů, toxinů, antigenů obecně pomocí známé protilátky (imunitní diagnostické sérum),

2) pro sérodiagnostiku - stanovení povahy protilátky v krevním séru pacienta na bakteriální, virové a méně často jiné infekční choroby pomocí známého antigenu (diagnosticum).

K určení generika, druhu a typu antigenu jsou zapotřebí známá imunodiagnostická séra. Získávají se opakovaným podáváním zvířatům (nejčastěji králíkům) ve zvyšujících se dávkách usmrcených nebo živých mikroorganismů, produktů jejich rozkladu, neutralizovaných nebo nativních toxinů. Po určitém cyklu imunizace zvířat se provádí masivní prokrvení nebo celkové vykrvení zvířete. Krev odebraná do sterilní nádoby se nejprve umístí do termostatu při teplotě 37°C na 4 - 6 hodin pro urychlení srážení, poté na jeden den do lednice. Vzniklé průhledné sérum se odsaje do sterilní nádobky, přidají se konzervační látky, stanoví se titr protilátek, zkontroluje se sterilita a nalije se do ampulí.

Jsou používány neadsorbovaný A adsorbované diagnostická séra. Neadsorbovaná séra mají vysoké titry protilátek, ale jsou schopna vyvolat skupinové (křížové) reakce.

Adsorbovaná séra se vyznačují přísnou specificitou účinku (reagují pouze s homologním antigenem). Nazývají se séra obsahující protilátky pouze proti jednomu specifickému antigenu monoreceptor.

Produkují také séra značená fluorochromy, enzymy a radioizotopy, které umožňují vysoký stupeň přesně detekovat i stopy antigenu.

Suspenze živých nebo usmrcených bakterií, produktů jejich rozpadu, toxinů a virů se používají jako antigeny (diagnostika) v sérologických reakcích. V některých případech se používají extrakty nebo chemicky izolované antigeny z mikroorganismů a živočišných tkání.

Všechny imunomikrobiologické metody lze rozdělit do 3 skupin:

1) na základě přímá interakce antigenu s protilátkou(jevy aglutinace, precipitace, hemaglutinace, imobilizace atd.);

2) na základě zprostředkovaná interakce antigenu s protilátkou(reakce nepřímé hemaglutinace, koaglutinace, latexové aglutinace, uhlíkové aglomerace, bentonitové aglutinace, fixace komplementu atd.);

3) pomocí značené protilátky nebo antigeny(metoda fluorescenčních protilátek, enzymatické imunoanalýzy a radioimunoanalýzy a další metody).

AGLUTINAČNÍ REAKCE

Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.

K provedení aglutinační reakce(RA) jsou zapotřebí tři složky: 1) antigen (aglutinogen);

2) protilátka (aglutinin)

3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).

Přibližná aglutinační reakce (RA)

Indikativní nebo destička RA se umístí na podložní sklíčko při pokojové teplotě. K tomu použijte Pasteurovu pipetu a naneste odděleně na sklenici kapku séra v ředění 1:10 až 1:20 a kontrolní kapku izotonického roztoku chloridu sodného. Do obou bakteriologických smyček se zavedou kolonie nebo denní kultura bakterií (kapka diagnostica) a důkladně se promísí. Reakce jsou zohledněny vizuálně po několika minutách, někdy pomocí lupy (x5). Při pozitivní RA je v kapce séra zaznamenán výskyt velkých a malých vloček, při negativní RA zůstává sérum rovnoměrně zakalené.

Detailní aglutinační reakce za účelem identifikace titru specifických protilátek u pacienta.

Plně rozvinutá RA pro sérodiagnostiku se provádí v séru pacientů. Ředí se také v izotonickém roztoku chloridu sodného od 1:50 - 1:100 do 1:800 nebo 1:1600, protože nižší sérové ​​titry mohou obsahovat normální aglutininy nalezené u zdravých lidí nebo pacientů s jinou diagnózou (diagnostický titr). Jako antigen v této reakci se používají diagnostická - známé suspenze, obvykle usmrcených bakterií.

Do aglutinačních zkumavek se nejprve nalije 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Do prvního z nich se přidá 1 ml séra zředěného 1:100 a po jeho promíchání se 1 ml přenese do druhého, z druhého na třetí atd. K výsledným dvojnásobným ředěním sér (od 1:100 do 1:1600 nebo více) se přidají 1-2 kapky bakteriální suspenze obsahující 3 miliardy mikrobiálních tělísek v 1 ml. Zkumavky se protřepou a umístí na 2 hodiny do termostatu při 37 °C, poté se udržují při teplotě místnosti po dobu 24 hodin.

Podrobná aglutinační reakce se zohledňuje postupným vyhodnocením každé zkumavky, počínaje kontrolními, za mírného protřepání. V kontrolních zkumavkách by neměla být žádná aglutinace. Intenzita aglutinační reakce je označena následujícími znaky: ++++ - úplná aglutinace (aglutinace vloček v absolutně průhledné kapalině); +++ - neúplná aglutinace (vločky v mírně opalescentní kapalině); ++ - částečná aglutinace (vločky jsou jasně viditelné, kapalina je mírně zakalená); + - slabá, pochybná aglutinace - kapalina je velmi zakalená, vločky v ní jsou těžko rozlišitelné; - - absence aglutinace (kapalina je rovnoměrně zakalená).

Za titr séra se považuje jeho poslední ředění, ve kterém je intenzita aglutinace hodnocena jako ne méně než dva plusy (++)