Coombsův pokus o významech a definicích. Přímý test kombů

- antiglobulinový test zaměřený na zjištění v Rh-negativní krvi neúplných antierytrocytárních protilátek proti Rh faktoru - specifickému proteinu, který se nachází na povrchu erytrocytů Rh-pozitivní krve. Existují dva typy tohoto testu: přímý - průkaz protilátek na povrchu červených krvinek, nepřímý - průkaz protilátek v krevním séru. Přímý test se provádí při diagnostice a sledování léčby krevních onemocnění: hemolytická anémie, hemolytické onemocnění novorozenci a další. Nepřímý test se provádí k posouzení kompatibility krve dárce a příjemce během transfuze a také ke zjištění přítomnosti a rizika Rh konfliktu při plánování a řízení těhotenství. Materiál pro Coombsův test je odkysličená krev Studie se provádí metodami založenými na aglutinační reakci. Normálně oba testy dávají negativní výsledek. Analýza se provádí během jednoho dne.

Coombsův test - klinické hodnocení Rh-negativní krev, zaměřená na průkaz protilátek proti Rh faktoru. Test se používá k identifikaci rizika rozvoje Rhesus konfliktu a hemolytických reakcí. U každého člověka obsahuje povrch erytrocytů určitý soubor antigenů nebo aglutinogenů – sloučenin různé povahy, jejichž přítomnost či nepřítomnost slouží k posouzení krevní skupiny a Rh faktoru. Existuje mnoho druhů antigenů, v lékařské praxi mají největší praktický význam aglutinogeny A a B, které určují krevní skupinu, a aglutinogen D, Rh faktor. Při pozitivním Rh faktoru jsou na vnější membráně erytrocytů detekovány antigeny D, s negativním - ne.

Coombsův test, který se také nazývá antiglobulinový test, je zaměřen na detekci neúplných antierytrocytárních protilátek proti systému Rh faktoru v krvi. Protilátky proti Rh faktoru jsou specifické imunoglobuliny, které se tvoří v Rh-negativní krvi, když do ní vstoupí erytrocyty s aglutinogeny D. K tomu může dojít při smíchání krve plodu a těhotné ženy, přičemž krevní transfuze se provádějí bez předchozího stanovení krevní skupiny. Coombsův test existuje ve dvou verzích – přímé a nepřímé. Při provádění přímého Coombsova testu jsou detekovány protilátky připojené k povrchu červených krvinek. Studie se používá k určení příčiny hemolytické reakce. Nepřímý Coombsův test je zaměřen na průkaz protilátek proti erytrocytům v krevní plazmě. Je nutné zjistit kompatibilitu krve dárce a příjemce nebo matky a plodu, pomáhá předcházet rozvoji Rhesus konfliktu a následné hemolýze červených krvinek.

Krev pro obě varianty Coombsova testu se odebírá ze žíly. Analýza se provádí aglutinační metodou s použitím antiglobulinového séra. Výsledky studie jsou využívány v hematologii při identifikaci příčin hemolytických reakcí, v chirurgii a resuscitaci při krevních transfuzích, v porodnictví a gynekologii při sledování těhotenství u žen s Rh negativní krví.

Indikace

Přímý Coombsův test, který detekuje protilátky navázané na povrchu červených krvinek, je předepisován pro hemolytické reakce (destrukce červených krvinek) různého původu. Studie je indikována pro primární autoimunitní hemolytickou anémii, posttransfuzní hemolytickou anémii, hemolytické onemocnění novorozenců, hemolýzu erytrocytů způsobenou autoimunitními, neoplastickými nebo infekčními onemocněními, jakož i odběry léky např. chinidin, methyldopa, prokainamid. K prevenci rozvoje Rhesusova konfliktu se používá nepřímý Coombsův test, který detekuje protilátky v krevní plazmě. Je indikován pro pacienty při přípravě na krevní transfuze a také pro těhotné ženy s negativním Rh faktorem za předpokladu, že budoucí otec dítěte má pozitivní Rh faktor.

Za účelem stanovení Rh kompatibility se Coombsův test nepodává pacientům s Rh-pozitivní krví. V těchto případech jsou již na povrchu červených krvinek antigeny, tvorbu protilátek nelze vyvolat krevní transfuzí ani pronikáním krve plodu do krevního oběhu těhotné. Studie také není indikována pro těhotné ženy, pokud mají oba rodiče negativní Rh faktor, což je dědičný recesivní znak. Dítě v takových párech má vždy Rh-negativní krev, imunologický konflikt s matkou je nemožný. U hemolytických patologií se antiglobulinový test nepoužívá ke sledování úspěšnosti terapie, protože výsledky neodrážejí aktivitu procesu destrukce erytrocytů.

Limitací Coombsova testu je složitost výzkumného postupu - pro získání spolehlivých výsledků je nutné dodržet teplotní a časové podmínky, pravidla pro přípravu činidel a biomateriálu. Výhodou Coombsova testu je jeho vysoká citlivost. U hemolytické anémie zůstávají výsledky tohoto testu pozitivní, i když se hemoglobin, bilirubin a retikulocyty vrátí k normálu.

Příprava na analýzu a sběr materiálu

Materiálem pro provedení Coombsova testu je žilní krev. Nejsou žádné zvláštní požadavky na dobu odběru krve a na přípravu pacienta. Jako u každé jiné studie se doporučuje udělat si pauzu po jídle alespoň 4 hodiny a na posledních 30 minut přestat kouřit, fyzická aktivita vyhnout se emočnímu stresu. Vyplatí se také předem prodiskutovat s lékařem nutnost vysazení léků – některé léky mohou zkreslit výsledky Coombsova testu. Krev se odebírá injekční stříkačkou z loketní žíly, méně často ze žíly na hřbetu ruky. Během několika hodin je materiál doručen do laboratoře.

Při provádění přímého Coombsova testu se do krevního séra pacienta přidá antiglobulinové sérum. Po nějaké době se směs vyšetří na přítomnost aglutinátů – ty se tvoří, pokud jsou na červených krvinkách protilátky. Při pozitivním výsledku se stanoví aglutinační titr. Nepřímý Coombsův test se skládá z více kroků. Nejprve se protilátky přítomné v séru fixují na injikované erytrocyty během inkubace. Poté se ke vzorku přidá antiglobulinové sérum, po chvíli se stanoví přítomnost a titr aglutinátů. Doba analýzy je 1 den.

Normální výsledky

Normálně je výsledek přímého Coombsova testu negativní (-). To znamená, že v krvi nejsou žádné protilátky spojené s červenými krvinkami a nemohou být příčinou hemolýzy. Normální výsledek nepřímý Coombsův test je také negativní (-), to znamená, že v krevní plazmě nejsou žádné protilátky proti Rh faktoru. Při přípravě na transfuzi krve pro příjemce to znamená kompatibilitu s krví dárce, při sledování těhotenství - absence Rh senzibilizace matky, nízké riziko rozvoj imunologického konfliktu. Fyziologické faktory jako stravovací návyky popř fyzická aktivita, nemůže ovlivnit výsledek testu. Pokud je tedy výsledek pozitivní, je nutná konzultace s lékařem.

Diagnostická hodnota analýzy

Pozitivní výsledek Coombsova testu je vyjádřen kvalitativně, od (+) do (++++), nebo kvantitativně, v titrech od 1:16 do 1:256. Stanovení koncentrace protilátek na erytrocytech a v krevním séru se provádí u obou typů vzorků. Při pozitivním výsledku přímého Coombsova testu jsou na vnější membráně červených krvinek detekovány protilátky, které vedou k destrukci těchto krvinek. Příčinou může být krevní transfuze bez předchozí typizace - potransfuzní hemolytická reakce, dále erytroblastóza novorozence, hemolytická reakce v důsledku užívání léků, primární nebo sekundární autoimunitní hemolytická anémie. Sekundární destrukci erytrocytů může způsobit systémový lupus erythematodes, Evansův syndrom, Waldenströmova makroglobulinémie, paroxysmální studená hemoglobinurie, chronická lymfocytární leukémie, lymfom, infekční mononukleóza, syfilis, mykoplazmatická pneumonie.

Pozitivní výsledek nepřímého Coombsova testu ukazuje na přítomnost protilátek proti Rh faktoru v plazmě. V praxi to znamená, že došlo k Rh senzibilizaci, existuje možnost rozvoje Rh konfliktu po infuzi dárcovské krve v těhotenství. Aby se předešlo těhotenským komplikacím, jsou ženy s pozitivním výsledkem Coombsova testu umístěny do zvláštních záznamů.

Léčba odchylek od normy

Coombsův test odkazuje na izoserologické studie. Jeho výsledky umožňují identifikovat hemolytickou reakci a také určit kompatibilitu krve dárce a příjemce, matky a plodu, aby se zabránilo rozvoji konfliktu Rhesus. Pokud je výsledek testu pozitivní, pak je nutné požádat o radu ošetřujícího lékaře - porodníka-gynekologa, hematologa, chirurga.

Přímý Coombsův test. Pomocí tohoto testu se prokáže přítomnost blokujících protilátek fixovaných erytrocyty dítěte. Pozitivní přímý test indikuje senzibilizaci a je silnou známkou hemolytického onemocnění novorozence ještě dříve, než se objeví ostatní. klinické příznaky. Výjimečně a jen ve velmi těžké případy přímý Coombsův test může být negativní vzhledem k již nastupující, téměř úplné hemolýze senzibilizovaných erytrocytů.

Přímý Coombsův test se provádí následovně: 5 kapek krve odebrané z patičky dítěte se umístí do zkumavky a přidá se 5 ml fyziologického roztoku. Dobře promíchejte a centrifugujte 10 min. Ze sedimentu erytrocytů se oddělí čirá kapalina. Poté znovu přidejte 5 ml fyziologického roztoku, promíchejte a odstřeďte. Po trojnásobném smíchání s fyziologickým roztokem se erytrocyty dobře promyjí. Po poslední separaci supernatantu se sediment erytrocytů v množství 0,1 ml smíchá s 0,9 ml fyziologického roztoku. Naneste 2-3 kapky této směsi na podložní sklíčko a přidejte jednu kapku Coombsova séra. Přítomnost aglutinace naznačuje, že reakce je pozitivní (pozitivní přímý Coombsův test). Studie by měla být provedena při pokojové teplotě nad 16 °C, aby se zabránilo působení studených aglutininů.

Nepřímý Coombsův test slouží jako důkaz přítomnosti volných protilátek v mateřském séru a provádí se s mateřským sérem.

Hemolytická nemoc u novorozence s Rh inkompatibilitou se obvykle projevuje po druhém těhotenství. První dítě se rodí zdravé, druhé se známkami mírné anémie a teprve po třetím těhotenství se rodí děti s jasné známky hemolytické onemocnění. Pouze u dříve senzibilizovaných žen během prvního těhotenství se může narodit dítě s příznaky hemolytického onemocnění. V některých případech imunizace způsobuje potraty a mrtvě narozené děti. Pro vznik a závažnost onemocnění je důležitý stav placenty a délka expozice mateřským aglutininům na plod. S výskytem aglutininů 10-14 týdnů před narozením má dítě obvykle subklinické formy. Časný výskyt aglutininů, 15-26 týdnů před porodem, způsobuje těžké formy onemocnění. U všech forem onemocnění je hlavním procesem hemolýza. Důsledkem reakce antigen-protilátka je hemolýza, poškození jaterních a mozkových kapilár. V závislosti na tom, která léze převládá, existují také různé formy nemocí. Nebezpečné jsou i některé anafylaktické jevy. Vedou k tvorbě látek podobných histaminu, které způsobují vážné poškození jaterních buněk a zejména gangliových buněk bazálních jader, amonného rohu, prodloužené míchy a dokonce i mozkové kůry. S poškozením jaterních buněk se k extrahepatální žloutence přidává jaterní žloutenka. Děti umírají s vážnými příznaky jaderné žloutenky. Pokud přežijí, příznaky lézí zůstávají. nervový systém(poruchy extrapyramidového systému s choreoatetickými pohyby, druhem taneční chůze, nucené pohyby hlavy, někdy porucha koordinace volních pohybů s častými pády, zvýšený tón svalů, mentální retardace, t. j. se známkami tkz. encephalopathia posticteria infantum).

Antiglobulinový test určený k detekci nekompletních protilátek proti erytrocytům byl navržen Coombsem, Morantem, Reisem v roce 1945 a později byl nazván Coombsův test. Podstata této metody spočívá v tom, že antiglobulinové sérum obsahující protilátky proti lidským imunoglobulinům vede při reakci s erytrocyty senzibilizovanými nekompletními protilátkami k jejich aglutinaci.

V závislosti na tom, zda jsou protilátky fixovány na povrchu červených krvinek nebo jsou volné v krevní plazmě, se používá přímý nebo nepřímý Coombsův test.

Přímý Coombsův test se provádí v případech, kdy existuje důvod se domnívat, že zkoumané červené krvinky již jsou in vivo byly senzibilizovány vhodnými protilátkami, tzn. v těle nastala první fáze reakce - fixace protilátek na povrchu erytrocytů a následné přidání antiglobulinového séra způsobuje aglutinaci senzibilizovaných buněk.

Pomocí nepřímého Coombsova testu jsou detekovány neúplné protilátky přítomné v testovacím séru. V tomto případě reakce probíhá ve dvou fázích. První fází je inkubace testovacích erytrocytů s testovacím sérem, při které se protilátky obsažené ve vzorku testovacího séra fixují na povrch erytrocytů. Druhým stupněm je přidání antiglobulinového séra.

Coombsův test byl dosud široce používán v laboratorní praxi pro diagnostiku imunopatologických stavů, zejména u autoimunitních hemolytických anémií, charakterizovaných destrukcí erytrocytů v důsledku vazby buněčné membrány na protilátky a (nebo) složky komplementový systém. S jeho pomocí se zjišťuje přítomnost Ig G (obvykle Ig G1 a Ig G3) na membráně erytrocytů, které mohou aktivovat komplement, někdy i komplement (C3d). Nicméně, v akutním období onemocnění, v důsledku zničení erytrocytů, na kterých velký počet protilátky, s hemolytickou krizí, stejně jako s nedostatečným množstvím protilátek v chronickém průběhu onemocnění, může být zaznamenán negativní přímý Coombsův test.

Je třeba zdůraznit, že nepřímý Coombsův test zůstává nejlepší metoda individuální výběr transfuzních médií, protože umožňuje nejpřesněji určit individuální kompatibilitu dárce a příjemce pro erytrocytární antigeny.

Dodatečný přímý antiglobulinový test na přítomnost autoprotilátek se doporučuje při vyšetření všech příjemců orgánů a tkání v předtransplantačním období a příjemců krvetvorných buněk i po transplantaci.

Kromě imunohematologie a transfuziologie mají antiglobulinové testy široké uplatnění v diagnostice řady patologických stavů: u hematologických onemocnění včetně lymfoproliferativních, v systémová onemocnění pojivové tkáně, Sjögrenova choroba, chronická aktivní hepatitida atd.

Coombsovy testy se aktivně používají v lékařské genetice a soudním lékařství ke stanovení povrchových erytrocytárních antigenů.

Coombsův test je poměrně časově náročná výzkumná metoda, která vyžaduje zvláštní péči při její implementaci. Při jeho použití jsou určité potíže spojené zejména s interpretací slabě pozitivních reakcí. Je známo, že falešně slabé pozitivní nebo negativní reakce při provádění Coombsových testů mohou být výsledkem nedostatečně účinného promývání erytrocytů, neutralizace antiglobulinového činidla stopami séra a kontaktu s neodtučněným povrchem, na který lze antiglobulin fixovat, ztrácí svou aktivitu. Další nevýhodou Coombsova testu je nestabilita antiglobulinového činidla, jehož příprava a skladování má určité rysy, což také ztěžuje kvantifikaci hemaglutinační reakce s antiglobulinovým sérem.

Kromě toho studie provedené A. Holburnem, D. Voakem a kol. ukázaly, že nadměrné třepání během resuspendování suspenze červených krvinek může být příčinou falešně negativních výsledků. Chybné výsledky při provádění antiglobulinových testů mohou být také způsobeny přítomností příměsi antikomplementárních protilátek v antiglobulinovém činidle, zejména ke složkám komplementu C3d, C3c, C4c a C4d, které se během inkubace adsorbují na povrch testovacích erytrocytů a vytvářejí vzhled pozitivního výsledku.

Tyto nedostatky lze snadno odstranit důkladným promytím zkušebních vzorků a kontrolou reakčních podmínek.

V posledním desetiletí se pro snížení doby a citlivosti nepřímého Coombsova testu používal izotonický fyziologický roztok s nízkou iontovou silou (LISS).

Nespornou výhodou antiglobulinových testů je podle řady autorů jejich vysoká citlivost, která výrazně převyšuje rozlišení alternativní metody testy, které se používají k detekci neaglutinujících protilátek.

Porovnali jsme rozlišení metod pro studium krevních sér na přítomnost nekompletních protilátek pomocí polyglucinu, želatiny a antiglobulinového séra. V průběhu studie byly sledovány titry nekompletních anti-D protilátek ve 140 vzorcích krevního séra izoimunních dárců pomocí želatinových, polyglucinových a nepřímých antiglobulinových testů. Stanovení těchto metod bylo provedeno v souladu s obecně uznávanými metodami.

Bylo zjištěno, že z hlediska jejich rozlišení jsou metody průkazu senzibilizace erytrocytů anti-D protilátkami uspořádány následovně: nejcitlivější je nepřímý Coombsův test, dále želatinový test a nejméně vypovídající je polyglucinový test. Výsledky získané v této sérii experimentů plně odpovídají literárním údajům, což nám umožňuje učinit závěr, že citlivost Coombsových testů je dostatečně vysoká, což umožňuje s vysokou mírou jistoty identifikovat přítomnost antierytrocytárních protilátek v těle, které nezpůsobují aglutinaci červených krvinek.

V praxi Coombsových testů se však vyskytují případy, kdy neúplné protilátky detekovány nejsou, přestože klinický obraz onemocnění nebo předchozí imunizace na jejich možnou přítomnost poukazuje. V takových případech lze předpokládat, že množství protilátek není dostatečné k tomu, aby byly vysráženy protilátkami antiglobulinového séra.

Tento závěr byl potvrzen vlastním experimentem, ve kterém byla metodou analytické mikroelektroforézy buněk zjištěna přítomnost anti-D protilátek na testovaných erytrocytech, které nebyly detekovány nepřímým Coombsovým testem. V této sérii experimentů bylo antiglobulinové sérum přidáno do erytrocytů, předem inkubovaných se séry získanými z krve imunizovaných dárců, v období geneze protilátek na cestách, tzn. v období, kdy v nich známé metody včetně Coombsova testu protilátky neprokázaly.

V provedených studiích byla statisticky prokázána přítomnost nekompletních protilátek na povrchu erytrocytů. výrazná změna hodnoty elektroforetické mobility senzibilizovaných červených krvinek po přidání antiglobulinového séra. Je třeba poznamenat, že následně byly anti-D protilátky detekovány v krevním séru všech imunizovaných dárců v nepřímém Coombsově testu.

Gillerand a kol. také ukázaly, že antiglobulinové testy se vyznačují určitým prahem citlivosti: pozitivní výsledek je zaznamenán pouze tehdy, když je na povrchu jednoho erytrocytu fixováno alespoň 500 molekul Ig G.

V literatuře navíc existují důkazy, že případný negativní Coombsův výsledek může být způsoben nízkou afinitou protilátek senzibilizujících červené krvinky, v důsledku čehož se při promývání snadno vymyjí z povrchu červených krvinek.

S ohledem na výše uvedené lze usoudit, že v některých případech negativní výsledek Coombsova testu ještě není důkazem nepřítomnosti protilátek fixovaných na povrchu erytrocytů.

Je známo, že Coombsovy reakce jsou vysoce specifické a umožňují detekci většiny typů nekompletních protilátek. Jak však ukazují některá experimentální data, antiglobulinové testy mohou být pozitivní i v neimunologických podmínkách. E. Muirhead a kol. druhý den po podání fenylhydrazinu byl u psů pozorován pozitivní Coombsův test. Takový rychlý nástup pozitivní reakce svědčí proti její imunologické povaze a je spíše spojen s nespecifickou adsorpcí proteinu na povrchu erytrocytů.

M. Williams a kol. zjistili, že kyselina klavulanová může vyvolat i pozitivní reakci, která je podle autorů spojena s nespecifickou adsorpcí plazmatických proteinů na povrchu erytrocytů. Podobný účinek byl pozorován při léčbě cefalosporinovými antibiotiky.

Autoři výše uvedených studií zdůrazňují neimunologický charakter získaných pozitivních výsledků Coombsových testů a trvají na tom, že tyto látky jsou schopny způsobit modifikaci membrán červených krvinek, v důsledku čehož mohou erytrocyty adsorbovat proteiny (zejména albumin), které jsou normálně přítomny v krevní plazmě a nemají vlastnosti protilátek. Navíc je možné, že právě xenobiotikum adsorbované na buněčném povrchu slouží jako spojovací článek mezi buněčnou membránou a plazmatickými proteiny.

Pro správnou interpretaci výsledků nastavení antiglobulinových testů je třeba vzít v úvahu také kvantitativní poměr mezi mladými a zralými erytrocyty v periferní krvi. Bylo zjištěno, že retikulocyty izolované z těla v období zvýšené regenerace erythronu mohou být aglutinovány antiglobulinovým sérem.

Pozitivní výsledek přímého antiglobulinového testu Používá se také při různých patologických stavech doprovázených poruchami imunitní systém, zánětlivé procesy což vede k nespecifické adsorpci protilátek různé specificity na membránách erytrocytů. To naznačuje, že molekuly Ig G neinteragují s specifické antigeny erytrocyty, ale pouze fixované na povrchu studovaných buněk.

Je třeba mít na paměti, že při nastavování Coombsova testu v případech onemocnění charakterizovaných rozvojem dysproteinémie nebo výskytem paraproteinů je pozitivní výsledek způsoben přítomností na povrchu erytrocytů proteinů, které nemají vlastnosti protilátky, což ukazuje i na nedostatečnou specifitu antiglobulinových testů s ohledem na povahu s jejich pomocí detekovaného proteinu.

Jak tedy ukazují četné studie, pozitivní výsledky přímých a nepřímých antiglobulinových testů nejsou absolutním důkazem přítomnosti protilátek, protože pozitivní reakce lze pozorovat také u různých patologických stavů, které nejsou spojeny s izosenzibilizací nebo autosenzibilizací těla. Proto pouze srovnání výsledků více imunosérologických metod s klinický obraz onemocnění umožňuje plně posoudit vyvíjející se patologický proces.

Pozitivní nepřímý antiglobulinový test s negativním přímým testem obvykle indikuje přítomnost volných aloprotilátek v testovaném séru, související s předchozími krevními transfuzemi nebo těhotenstvím.

Coombsův test je často pozitivní během exacerbace paroxysmální noční hemoglobinurie; pozitivní Coombsův test s anti-C3 a anti-C3dg je markerem studené aglutininové choroby.

V případech, kdy je vysoké riziko rozvoje hemolytického onemocnění novorozence, velká důležitost pro diagnostiku (nejčastěji v těhotenství) a případně dynamické sledování vzhledu a změny titru protilátek, mít výsledky přímých i nepřímých antiglobulinových testů. Nejčastěji je hemolytické onemocnění novorozence spojeno s inkompatibilitou mezi matkou a plodem pro antigen D, méně často pro antigeny systému AB0 a ještě méně často pro jiné antigeny (C, c, K aj.). Výsledné protilátky la, které jsou zpravidla neúplnými protilátkami třídy Ig G, jsou jednoznačně detekovány nepřímým antiglobulinovým testem. U tohoto onemocnění má velký význam správně stanovený titr a specificita detekovaných protilátek, neboť existuje určitá korelace mezi hladinou antierytrocytárních protilátek v krvi těhotné ženy a možnou prognózou závažnosti hemolytického onemocnění.

Je také zapotřebí nepřímý Coombsův test klinická praxe aby byla zajištěna bezpečná transfuzní terapie. Jeho provádění je povinnou součástí imunohematologických studií dárců a různých kategorií příjemců, stejně jako rutinních vyšetření všech pacientů zdravotnických zařízení, kteří mohou potřebovat transfuzi krve a jejích složek.

Nepřímý antiglobulinový test se používá v následujících případech:

Pro přesnější určení Rh příslušnosti (antigen D) s fuzzy výsledky stanovení Rh faktoru jinými metodami (polyglucin, želatina apod.);

K detekci slabých erytrocytárních antigenů (systémy Kell, Duffy, Kidd, Lewis atd.) a protilátek proti těmto antigenům;

Pro detekci a identifikaci aloimunitních antierytrocytárních protilátek, včetně protilátek, které způsobují hemolytické potransfuzní reakce;

Stanovit přítomnost imunitních protilátek systému AB0 u transfuzních hemolytických komplikací;

Jako test kompatibility pro individuální výběr transfuzované krve a jejích složek.

Coombsův test je tedy důležitým diagnostickým testem používaným v různých oblastech medicíny (hematologie, porodnictví, revmatologie, transfuziologie, klinická a laboratorní diagnostika atd.). Znalost charakteristik Coombsova testu pomůže zvýšit spolehlivost výsledků a přispěje ke správné interpretaci laboratorních dat.

Literatura

1. Protilátky. Metody / ed. D. Cathy. — M.: Mir, 1991.

2. Bayramalibeyli I.E., Rahimov A.A., Gadzhiev A.B.. // Transfuzní terapie anémie: učebnice. průvodce pro lékaře. - M .: Prakt. lékařství, 2005. - S. 105-106.

3. Volkova O.Ya., Fregatova L.M., Levchenko L.B.// Transfuziologie. - 2006. - č. 2. - S. 39-62.

4. Donskov S.I.// Krevní skupiny systému Rhesus: teorie a praxe. - M.: VINITI RAN, 2005. - S. 180-186, 195.

5.Imunoserologie (normativní dokumenty) / komp. A.G. Bashlay, S.I. Donskov. — M.: VINITI RAN, 1998.

6.Výzkum krevního systému v klinické praxi / ed. G.I. Kozintsa, V.A. Makarov. — M.: Triada-X, 1997.

7. Levin V.I. K mechanismu erytrodiézy a erytropoézy v období akutní posthemoragické anémie: Ph.D. dis. …bonbón. Miláček. vědy. - Minsk, 1968.

8. Rahimov A.A., Bairamalibeyli I.E.. // Základy diagnostiky, prevence a léčby anémie. - M .: GOU VUNMTs Ministerstva zdravotnictví Ruské federace, 2002. - S. 204-209.

9. Čumaková E.D.. // Skutečné problémy hematologie a transfuziologie: materiály VI. kongresu hematologů a transfuziologů Běloruské republiky, Minsk, 24.-25. května 2007 / ed. A.I. Svirnovský, M.P. Potapnev. - Minsk: Republikánské vědecké a praktické centrum pro hematologii a transfuziologii, 2007. - S. 50.

10. Coombs R., Mourant A., Race R. // Lancet. - 1945. - Sv. 2. - S. 15.

11. Freedman J. // J. Clin. Pathol. - 1979. - Sv. 32. - S. 1014-1018.

12. Holburn A.M. kontrola kvality. Metody v hematologii / ed. I. Cavill. - Edinburg: Churchill Livingstone, 1982. - Sv. 4. - S. 34-50.

13. Khan S.// CMAJ. - 2006. - Sv. 175, č. 8. - S. 919.

14. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Sv. 63 (dod. 7). - S. 719-721.

15. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Sv. 63 (dod. 7). - S. 716-718.

16. Molthan L., Reidenberg M.M., Eihman M.F.// New Engl. J. Med. —1976. — Sv. 277. - S. 123-125.

17. Muirhead E.E., HájeM., Brian S. // J. Lab. Clin. Med. —1954. — Sv. 44. - S. 902-903.

18. Rosse W.F.//Hosp. Prac. - 1995. - N 105.

19. Voak D., Downie D., Mooreb. a kol. //Biotests Bull. - 1986. - Sv. 1. - S. 41-52.

20. Voak D., Haigh T., Downie D. a kol. Myčky buněk pro antiglobulinové testy. Opakované testování – nová metoda prokazující neúčinnost jednoho široce používaného stroje – Sorvall CW1-AF2: zpráva technickému oddělení DHSS, únor 1991.

21. Williams M.E., Thomas D., Harman C.P. a kol. //Antimikrobiální látky a chemoterapie. -1985. - S. 125-127.

22. Zarandona J.M., Yazer M.H. // CMAJ. - 2006. - Sv. 174, č. 3. - S. 305-307.

Lékařské novinky. - 2008. - č. 3. - S. 33-36.

Pozornost! Článek je určen lékařským specialistům. Přetištění tohoto článku nebo jeho částí na internetu bez hypertextového odkazu na původní zdroj je považováno za porušení autorských práv.

Coombsův test- analýza k detekci protilátek připojených k povrchu nebo rozpuštěných v plazmě. S jeho pomocí se zjišťuje imunizace a protilátky proti červeným krvinkám. Druhý název je antiglobulinový test. Děje se to přímo i nepřímo.

Na přímý antiglobulinový test detekuje protilátky fixované na povrchu erytrocytů. Provádí se s podezřením na jiné autoimunitní onemocnění po užití léků (methyldopa, penicilin, chinin) a.

Erytrocyty byly senzibilizovány in vivo – protilátky jsou na nich již pevně navázány a přidáním antiglobulinového séra (anti-IgG) dochází ke slepení senzibilizovaných buněk, což je viditelné pouhým okem.

Nepřímý Coombsův test detekuje antierytrocytární protilátky v krevní plazmě, provádí se před krevní transfuzí a během.

Antierytrocytární protilátky – typ autoprotilátek, tzn. protilátky proti vlastním tkáním. K autoprotilátce dochází, když imunitní systém abnormálně reaguje na určité léky, jako jsou vysoké dávky penicilinu.

Erytrocyty na svém povrchu obsahují různé chemické struktury (glykolipidy, sacharidy, glykoproteiny a proteiny), které se v medicíně nazývají antigeny. Člověk zdědí od svých rodičů určitou mapu antigenů na každé červené krvince.

Antigeny se spojují do skupin a vedle toho se krev dělí do několika skupin - podle systému AB0 Rh, Kell, Lewis, Kidd, Duffy. Nejznámější a nejvýznamnější v práci lékaře jsou AB0 a Rh faktor (Rh).

Systém AB0

Rh-příslušnost osoby je určena přítomností těchto antigenů. Zvláště důležitým erytrocytárním antigenem je antigen D. Pokud je přítomen, pak se mluví o Rh-pozitivní krev RhD, a pokud není - o Rh negativní Rhd.

Pokud se odpovídající protilátka spojí s antigeny erytrocytů, pak je erytrocyt zničen - dojde k hemolýza.

Indikace

Hlavní indikace pro Přímoantiglobulinový test- Podezření na hemolytickou anémii. Nejčastěji se provádí při primární autoimunitní hemolytické anémii, hemolýze s revmatickým, nádorovým, infekční choroby hemolýza vyvolaná léky.

Pokud se anémie objeví několik dní nebo měsíců po krevní transfuzi nebo s prodlouženou žloutenkou u novorozence, provádí se také přímý Coombsův test.

Nepřímýproveden antiglobulinový test před krevní transfuzí a během těhotenství Rh negativní ženy.

Autoimunitní hemolytická anémie

Autoimunitní hemolytická anémie (primární) je klasické autoimunitní onemocnění s neznámými příčinami. Interakce uvnitř imunitního systému je narušena, což vede k vnímání vlastních erytrocytů jako cizích. V lymfatických uzlinách se syntetizují protilátky třídy IgG (reagují při t 37 °C) a/nebo IgM (při t 40 °C), které po připojení na povrch erytrocytu nastartují řadu enzymů (tzv. komplementový systém) a „proděraví“ stěnu erytrocytu, což vede k její destrukci – hemolýze.

První příznaky jsou způsobeny jak destrukcí červených krvinek, tak poklesem hemoglobinu. Mezi nimi:

• únava, celková slabost, podrážděnost
• dušnost
• bolest břicha a hrudníku, nevolnost
• tmavá barva moči
• bolesti zad
• ikterické zbarvení kůže a sliznic
• snížení počtu erytrocytů a

pozitivní přímý výsledek Coombsův test 100% potvrzuje diagnózu autoimunitní hemolytické anémie, prokazuje její autoimunitní původ. Negativní výsledek zároveň neumožňuje odstranit diagnózu.

Sekundární hemolytická anémie

Sekundární autoimunitní hemolytická anémie a pozitivní Coombsův test mohou být u následujících onemocnění:

• Evansův syndrom
• infekce pneumonie

Pozitivní antiglobulinový test u těchto onemocnění je jedním z příznaků, nikoli diagnostickým kritériem.

Hemolytická nemoc novorozence

Způsobit hemolytické onemocnění novorozence inkompatibilita krevní skupiny u matky a plodu, ve většině případů podle systému Rh, v ojedinělých případech - podle systému AB0, kazuisticky - podle jiných antigenů.

Rh-konflikt se rozvine, pokud u Rh-negativní ženy plod zdědil Rh-pozitivní krev od jejího otce.

Onemocnění u novorozence se rozvine pouze v případě, že matka již vytvořila protilátky proti odpovídajícím antigenům, což se děje po předchozích těhotenstvích, potratech, transfuzích nekompatibilní krve. Většina běžná příčina spuštění syntézy protilátek proti antigenům membrány erytrocytů - porod (feto-mateřské krvácení). První porody většinou probíhají bez komplikací, ale další porody jsou v prvních dnech po porodu plné hemolytického onemocnění novorozence.

Příznaky hemolytického onemocnění novorozence:

• zežloutnutí kůže
• a hlenovitý
• zvětšení jater a sleziny
• respirační poruchy
• otok celého těla
• excitace a postupná deprese centrálního nervového systému

Anémie po krevní transfuzi

Nepřímý Coombsův test provedené před krevní transfuzí k posouzení kompatibility, a přímý Coombsův test - po něm při podezření na potransfuzní hemolýzu, tzn. jestliže máte příznaky, jako je horečka, slzení (přečtěte si níže). Účelem testu je zjištění protilátek proti transfuzním erytrocytům, které se navázaly na erytrocyty příjemce a jsou příčinou posttransfuzní hemolýzy, a také předčasné odstranění dárcovských erytrocytů z oběhu příjemce (příjemce).

Příznaky:

• zvýšení tělesné teploty
• vyrážka na kůži
• bolesti zad
• Červené
• nevolnost
• závrať

Dešifrování

Stojí za připomenutí, že základní pravidla pro dekódování přímých a nepřímých antiglobulinových testů jsou stejná. Jediným rozdílem je umístění protilátek - v krvi nebo již na erytrocytu.

• Li přímý Coombsův test je negativní- znamená to, že protilátka „nesedí“ na erytrocytech a příčinu symptomů je třeba dále hledat a řešit nepřímý vzorek Coombs
• při pozitivním výsledku Coombsova testu po krevní transfuzi, infekcích, lécích - pozitivita trvá až 3 měsíce (životnost erytrocytů 120 dní - 3 měsíce)
• pozitivní výsledek antiglobulinového testu autoimunitní onemocnění trvá měsíce a dokonce roky

Norma

• přímý Coombsův test - negativní
• nepřímý Coombsův test - negativní

Kvalitativně se kladný výsledek měří v počtu plusů od jedné do čtyř (+, ++, +++, ++++) a kvantitativně v digitální podobě - ​​1:16, 1:256 atd.

Ano. Skutečnost, že jste dostali krevní transfuzi, musí být vašemu lékaři známa, protože to nyní ovlivňuje správnou interpretaci výsledků testu. Při příjmu cizí (i když mnohokrát testované krve) vždy existuje možnost, že si vaše tělo vytvoří protilátky proti transfúzní krvi. Právě tyto protilátky budou mít negativní dopad na zdraví. Při následných krevních transfuzích by měl lékař vědět, že jste již transfuze dostali, což znamená, že byl čas na syntézu protilátek. Pro těhotné ženy jsou tyto informace ještě relevantnější.

3. Pokud dojde k nesouladu Rh faktoru mezi matkou a dítětem, budou všechny děti nemocné?

Záleží na tom, zda je dítě Rh-pozitivní nebo negativní (RhD). Nositelé krevních skupin I, II, III a IV mohou být Rh-pozitivní i negativní. V situaci, kdy je matka Rh-negativní a dítě je Rh-pozitivní, se protilátky vytvoří již při prvním těhotenství, ale až po prvním porodu (nebo ukončení těhotenství) dojde k přímému kontaktu mezi krví matky. matka a dítě. Realizace hemolytického účinku protilátek bude až u druhého a dalších porodů, což povede k hemolytickému onemocnění novorozence.

Každá žena s negativním Rh faktorem by měla být během těhotenství a po porodu pečlivě vyšetřena, preventivní léčba aby se zabránilo vzniku protilátek a dalším komplikacím.

4. Je během těhotenství nutné znát krevní skupinu manžela před provedením Coombsova testu?

Krevní skupinu biologického otce dítěte je nutné v těhotenství nejen znát, ale i kontrolovat.

Data

• poprvé navržena v Cambridge v roce 1945
• práh citlivosti - alespoň 300 fixovaných molekul protilátky na jednom erytrocytu
• počet protilátek spouštějících hemolýzu - individuálně pro každou osobu (od 16-30 do 300)
• dynamika ostatních laboratorních ukazatelů hemolytické anémie (hemoglobin, bilirubin, retikulocyty) se může normalizovat a Coombsův test zůstane na stejné úrovni

Coombsův test byl naposledy upraven: 16. března 2018 Maria Bodyanová

Na misku nebo podložní sklíčko se nanese pipetami (různými!) 1 velká kapka séra O (I), A (II), B (III). Když si všimnete času, pomocí čisté skleněné tyčinky nebo čistého úhlu podložního sklíčka se kapky séra spojí s kapkami krve. Stanovení trvá 5 minut, protřepávání destičky, poté se do každé směsi kapek přidá 1 kapka fyziologického roztoku a vyhodnotí se výsledky. Je lepší, když je sérum 2 různé série. Výsledky krevních skupin se musí shodovat v obou sériích séra.

Vyhodnocení výsledků izohemaglutinace:

isohemaglutinace. Při pozitivní reakci se ve směsi objeví drobná červená zrnka lepivých červených krvinek. Zrna se spojují do větších zrn a ta do vloček. Sérum je téměř vybledlé;

při negativní reakci zůstává směs rovnoměrně zbarvená do růžova po dobu 5 minut a nejsou detekována žádná zrna;

při práci se 3 séry skupin O(I), A(II), B(III) jsou možné 4 kombinace reakcí:

1. pokud všechna 3 séra vykázala negativní reakci, to znamená, že směs je rovnoměrně zbarvená do růžova - to je krevní skupina O (I);

   pokud pouze sérum skupiny A (II) dalo negativní reakci a séra O (I) a B (III) poskytla pozitivní reakci, to znamená, že se objevila zrna - to je krevní skupina A (II);

   sérum skupiny B(II) vykazovalo negativní reakci a séra skupin O(I) a A(II) pozitivní reakci - to je krevní skupina B(III).

všechna 3 séra vykazovala pozitivní reakce - testovaná krev skupiny AB (IV). V tomto případě se studie provádí se sérem skupiny AB (IV).

Poznámka! Kapky studované krve by měly být 5-10krát menší než kapky séra.

Isohemaglutinační chyby.

Neaglutinace tam, kde by měla být, a aglutinace tam, kde by neměla být. To může být způsobeno nízkým titrem séra a špatnou aglutinací erytrocytů.

Přítomnost aglutinace tam, kde by neměla být- jedná se o pseudoaglutinaci, kdy hromady erytrocytů tvoří "sloupky mincí". Houpání talíře nebo přidávání fyziologického roztoku je ničí.

Panaglutinace, kdy sérum slepí všechny červené krvinky včetně vlastní krevní skupiny. Do 5. minuty známky aglutinace zmizí.

Dochází také k tzv. studené panaglutinaci, kdy se erytrocyty slepí kvůli nízké teplotě vzduchu (pod 15 °C) v místnosti.

Ve všech těchto případech se provádí buď opakovaná reakce, nebo podle standardních erytrocytů.

Stanovení Rh-příslušnosti krve

Ke stanovení Rh příslušnosti, tj. k detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti antigenů Rh systému v krvi lidí, se používají standardní anti-Rhesus séra (reagencie), která se liší specificitou, tj. obsahují protilátky ve vztahu k různé antigeny tohoto systému. Pro stanovení Rh 0 (D) antigenu se nejčastěji používá anti-Rhesus sérum s přídavkem 10% roztoku želatiny nebo se používá standardní anti-Rhesus činidlo předem připravené s 33% roztokem polyglucinu. K získání přesnějších výsledků studie, stejně jako k detekci antigenů jiných sérologických systémů, se používá Coombsův test (je také velmi citlivý při stanovení kompatibility transfundované krve). Pro studii se používá nativní krev nebo připravená s nějakým druhem konzervantu. V tomto případě by měla být krev vymyta z konzervační látky desetinásobným objemem izotonický roztok chlorid sodný. Při určování Rh-příslušnosti- Rh 0 (D) by měly být použity dva vzorky séra nebo anti-Rhesus reagencie dvou různých sérií a současně použít standardní erytrocyty získané z krve z krve Rh-pozitivních (Rh +) a Rh-negativních (Rh - ) Jednotlivci. Při stanovení dalších izoantigenů by měly být podle toho použity kontrolní erytrocyty, které obsahují nebo postrádají antigen, proti kterému jsou protilátky namířeny ve standardním séru.

Nekompletní tepelné aglutininy jsou nejčastějším typem protilátek, které mohou způsobit rozvoj autoimunitní hemolytické anémie. Tyto protilátky patří k IgG, zřídka - k IgM, IgA.

COOMBSOVÝ TEST

Coombsův test: úvod. Coombsův test je laboratorní diagnostická metoda založená na hemaglutinační reakci.

Hlavní metodou pro diagnostiku autoimunitní hemolytické anémie je Coombsův test. Je založena na schopnosti protilátek specifických pro imunoglobuliny (zejména IgG) nebo složky komplementu (zejména C3) aglutinovat erytrocyty potažené IgG nebo C3.

Vazba IgG a C3b na erytrocyty je pozorována u autoimunitní hemolytické anémie a polékové imunitní hemolytické anémie. Přímý Coombsův test. Přímý Coombsův test se používá k detekci protilátek nebo složek komplementu fixovaných na povrchu červených krvinek. Provádí se následovně:

K získání protilátek proti lidským imunoglobulinům (antiglobulinové sérum) nebo komplementu (antikomplementární sérum) je zvíře imunizováno lidským sérem, imunoglobuliny nebo lidským komplementem. Sérum získané ze zvířete je purifikováno od protilátek proti jiným proteinům.

Erytrocyty pacienta se promyjí fyziologickým roztokem, aby se úplně odstranilo sérum, které neutralizuje protilátky proti imunoglobulinům a komplementu a může způsobit falešně negativní výsledek.

Pokud jsou protilátky nebo složky komplementu fixovány na povrchu erytrocytů, přídavek antiglobulinu nebo antikomplementárního séra způsobuje aglutinaci erytrocytů.

Přímý Coombsův test se používá v následujících případech:

autoimunitní hemolýza.

Hemolytická nemoc novorozence.

Imunitní hemolytická anémie vyvolaná léky.

Hemolytické transfuzní reakce. Nepřímý Coombsův test. Nepřímý Coombsův test detekuje protilátky proti erytrocytům v séru. K tomu je pacientovo sérum inkubováno s dárcovskými erytrocyty skupiny 0 a poté je proveden přímý Coombsův test.

Nepřímý Coombsův test se používá v následujících případech:

Stanovení individuální kompatibility krve dárce a příjemce.

Detekce aloprotilátek, včetně protilátek, které způsobují hemolytické transfuzní reakce.

Stanovení povrchových erytrocytárních antigenů v lékařské genetice a soudním lékařství.

Potvrzení jednovaječných dvojčat při transplantaci kostní dřeně.

K provedení biologického testu se krev co nejrychleji podá transfuzí (nejlépe tryskou). Po transfuzi 25 ml krve se hadička systému upne svorkou. Poté se udělá pauza na 3 minuty, během které se sleduje stav příjemce. Pro přípravu biologického vzorku se třikrát vstříkne 25 ml krve. Na konci testu (po transfuzi prvních 75 ml krve ve zlomkových dávkách 25 ml v intervalech 3 minut) se systém upraví na požadovanou rychlost transfuze. Při transfuzi pacienta s více než jednou lahvičkou krve je nutné vyjmout jehlu ze žíly. V tomto případě se jehla vyjme ze zkumavky lahvičky, ve které vytekla krev, a vloží se do další lahvičky. Systémová trubka (pryžová nebo plastová) je v tomto okamžiku sevřena svorkou. Pokud je během krevní transfuze potřeba nitrožilně podat příjemci jakýkoli jiný lék, provede se to propíchnutím pryžové hadičky systému. Proražení plastové trubice je nepřijatelné, protože nespadne. Po každé krevní transfuzi musí být pacient sledován, aby byl identifikován a včas odstraněn možné komplikace včetně alergických reakcí. Tělesná teplota by měla být měřena 2 hodiny po ukončení krevní transfuze. Se zvýšením jeho měření je nutné opakovat v následujících 4 hodinách každou hodinu. Neméně důležité je sledování močení a složení moči, které umožňuje zjistit přítomnost toxické potransfuzní reakce. Vznik oligurie a anurie po krevní transfuzi, přítomnost krvinek a bílkovin v moči jsou přímým ukazatelem rozvoje posttransfuzní hemolýzy.