Mikrobiologija reakcije aglutinacije. Reakcija aglutinacije (RA)
Predavanje br. 16
Glossary
DIREKTNO - odmah pored bez ičega, bez praćenja linkova.
INDIREKTNO– kroz druge ćelije, ne direktno.
SMANJENJE ≠ POVEĆANJE (aktivnost ćelije).
ODBACI - ne prihvatiti, odbiti. Tijelo je odbacilo presađeni organ.
imunološke reakcije.
Reakcije imuniteta su reakcije specifične interakcije (vezivanja) antigena i antitijela ili antigena i senzibiliziranog T-limfocita.
Ove reakcije se odvijaju in vitro (u epruveti) i in vivo (u živom organizmu).
Serum je uključen u ove reakcije, pa se tako i zovu serološki.
imunološke reakcije su navikli dijagnostika zaraznih bolesti. U ovom slučaju, nepoznata komponenta je određena poznatom komponentom, koja se zasniva na specifičnosti interakcije antigena sa antitelom. Ako poznato antitelo, onda možeš identificirati (detektovati) nepoznati antigen. Ako poznati antigen, onda je moguće otkriti nepoznata antitijela.
Stoga se koriste imunološke reakcije:
1) za serološka dijagnostika (serodijagnostika) bolesti - otkrivanje u krvnom serumu bolesnih ljudi antitijela na specifičnog uzročnika zarazne bolesti (poznati antigen); ako su u krvnom serumu bolesne osobe prisutna antitijela na bilo koji patogen, onda je taj patogen izazvao ovu zaraznu bolest;
2) za serološka identifikacija (seroididentifikacija) mikroba - utvrđivanje vrste uzročnika bolesti pomoću imuno dijagnostičkih seruma (poznata antitijela); ako antitijela vežu patogen izolovan od bolesne osobe, onda je ovaj mikrob identičan onom kojim je životinja imunizirana primanje imuno dijagnostički serum .
Reakcije imuniteta se odvijaju u 2 faze:
1) specifična faza- povezivanje aktivnog centra antitela sa determinantnom grupom antigena sa formiranjem kompleksa antigen-antitelo; ova faza teče brzo, ali nema vidljivog efekta;
2) nespecifična faza- izgled vidljiv efekat interakcije antigen-antitijelo nacrt(aglutinacija) ili zamućenost(padavine), što dozvoljava vidi obrazovanje kompleksa antigen-antitelo i izvući zaključak o usklađenost antigena i antitijela jedno na drugo.
Imuni odgovori su reakcija aglutinacije (RA), reakcija precipitacije (RP), reakcija fiksacije komplementa (RCC).
Reakcija aglutinacije- to je adhezija i precipitacija mikrobnih ili drugih ćelija (eritrocita) pod dejstvom antitela u prisustvu elektrolita. Vidljivi efekat reakcije (fenomen aglutinacije) je stvaranje precipitata koji se tzv. aglutinirati.
Ova reakcija se koristi za serodijagnostika I seroididentifikacija. RA se koristi za serodijagnostiku (otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata) tifusne groznice i paratifus(Vidal reakcija), bruceloza(reakcija Wrighta), tularemija i leptospiroza. RA se koristi za seroidifikaciju (određivanje vrste patogena izolovanog od pacijenta) kada crijevne infekcije veliki kašalj, kolera i sl.
Komponentereakcije:
1. A antigen (aglutinogen) - to su cijele (ne uništene) mikrobne ili druge ćelije ( korpuskularno, nerastvorljivi antigen). Aglutinogeni- to je suspenzija živ ili ubijen mikrobne ćelije ili bilo koje druge ćelije. Antigeni mogu biti nepoznati ili poznati. Nepoznati aglutinogen je mikrobna kultura izolirana iz tijela pacijenta koju treba odrediti. poznati antigen. diagnosticum- dijagnostički lijek - suspenzija mrtvih mikrobi poznate vrste u fiziološkom rastvoru. Ova suspenzija maglovito (providno)), jer mikrobne ćelije se ne rastvaraju, već ostaju netaknute. Poznati aglutinogen će se koristiti za otkrivanje nepoznatih antitijela u serumu pacijenta.
2. Antitijelo (aglutinin)- nalazi se u krvnom serumu. Antitijela također mogu biti nepoznata ili poznata. U krvnom serumu nalaze se nepoznata antitijela koja treba odrediti bolesna osoba. Poznata antitela se nalaze u imunološki dijagnostički serumi, koji se zovu aglutinirajući serumi. Koriste se za seroidifikaciju, tj. za određivanje nepoznatog antigena – vrste mikrobne kulture.
3. Elektrolit- 0,9% rastvor natrijum hlorida.
Uradite dijagnostiku.
Čista kultura patogena poznate vrste koja se uzgaja na agar kosom (na primjer, uzročnik trbušnog tifusa) ispere se sa 3-4 ml izotonični rastvor, stavljen u sterilnu epruvetu, na neki način ubiti mikrobe (npr. prokuhavanjem i odrediti gustinu (u 1 ml bi trebalo biti 3 milijarde mikrobnih ćelija). Ako se mikrobne ćelije ubijaju. visoke temperature, tada dobijaju O-diagnosticum (O-antigen), ali ako se tretira formalinom, onda dobijaju H-diagnosticum (H-antigen).
Primjeri dijagnostikuma: salmonella diagnosticum, brucellosis diagnosticum, tularemia diagnosticum.
Dobivanje aglutinirajućih seruma.
Životinjama (obično zečevima) 5-7 puta u intervalima se parenteralno ubrizgavaju sve veće doze mikrobnih dijagnostikuma ( izvršiti hiperimunizaciju), a zatim im se uzima krvni serum koji sadrži antitijela na one mikrobe od kojih se priprema dijagnostikum. Ako se imunizacija provodi O-diagnosticumom, onda se dobijaju O-aglutinirajući serumi (sadrže O-antitijela), ako H-diagnosticum - H-aglutinirajući serumi.
Aglutinirajući serumi mogu biti neadsorbovan ili domaći i adsorbovan.
Neadsorbirani serumi sadrže grupna antitijela na nekoliko blisko povezanih mikrobnih vrsta.
Adsorbovani serumi sadrže antitijela na jedan ili više antigena jedne vrste mikroba. Ako serumi sadrže antitijela samo na jedan antigen, oni se nazivaju monoreceptor ili monovalentan ako na nekoliko antigena - grupa adsorbovani serumi .
Primjeri aglutinirajućih seruma:H-aglutinirajući serum salmonela monoreceptora, O-aglutinirajući serum adsorbiran salmonelom, O-aglutinirajući serum protiv kolere itd..
Titar aglutinirajući serum - najveće razrjeđenje seruma, pri kojem se još uvijek otkriva reakcija aglutinacije s antigenom (titar ovisi o količini antitijela u krvi: što je više antitijela, to je veći titar seruma).
Načini postavljanja RA.
1. Približan (ploča) RA- izvedeno na staklu. Nanesite 2 kapi seruma i 1 kap izotonične otopine na predmetno staklo. Mikrobna kultura se petljom unosi u jednu od kapi seruma i u kap izotonične otopine i miješa. Kap izotonične otopine sa klicama – kontrola antigena, kap serumi bez klica – kontrola antitela, kap serum sa mikrobima – iskustvo. Ako serum sadrži antitijela koja odgovaraju mikrobnim antigenima koji su pomiješani s njim, tada će se antitijela i antigeni specifično vezati jedni za druge i nakon 1-3 minute u eksperimentalnoj kapi će se pojaviti aglutinatne ljuspice. Kontrola antigena treba da bude mutna, a kontrola antitela bistra. Obračun rezultata reakcije vrši se pojavom pahuljica aglutinata . Ako ispadnu pahuljice, reakcija je pozitivna, tj. antigen odgovara antitelu, a antigen se može koristiti za identifikaciju antitela, ili obrnuto. Ako zamućenost ostane, reakcija je negativna.
2. Produžena reakcija aglutinacije - izvedeno u epruvetama. Prvo se pripremaju 2-struka razrjeđenja krvnog seruma bolesne osobe od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida se sipa u 6 epruveta. U prvu epruvetu se dodaje 1 ml pacijentovog krvnog seruma u razrjeđenju 1:50, miješa se i dobije se razrjeđenje 1:100, a zatim se 1 ml razrijeđenog 1:100 prenosi u drugu epruvetu. i dobije se razrjeđenje 1:200 itd. Ostavljene su dvije epruvete za kontrolu antigena i seruma. Kontroli seruma dodaje se samo serum razrijeđen 1:50, kontroli antigena se dodaje samo antigen. 0,1 ml antigena - diagnosticuma (O- ili H-) dodaje se u sve ostale epruvete i sve epruvete se stavljaju u termostat na 37°C na 18-20 sati. Obračun rezultata reakcije vrši se prema prirodi, količini nastalog taloga (aglutinata) i stepenu zamućenosti. Obračun se vrši samo sa sljedećim rezultatima u kontrolama: kontrola seruma - providna, kontrola antigena - zamućena. O-antitijela daju fino zrnati precipitat. H-antitijela - krupno zrnasta. Prema posljednjoj epruveti, u kojoj je još uvijek vidljiva reakcija aglutinacije, postavljeno dijagnostički titar.
Sa serodijagnozom bolesti, važno je ne samo otkriti specifična antitijela na određeni patogen, već i identificirati njihov broj, tj. ustanoviti takav titar antitela, da Kada možemo govoriti o prisutnosti bolesti uzrokovane ovim patogenom . Ovaj titar se naziva dijagnostički titar. Na primjer, za dijagnosticiranje trbušnog tifusa potrebno je otkriti titar antitijela 1:400, ali ne manje. Čak više tačne rezultate daje detekcija porasta antitijela u uparenim serumima. Pacijentov serum se uzima na početku bolesti i nakon 3-5 ili više dana. Dakle, ako se titar antitijela poveća za najmanje 4 puta, možemo govoriti o trenutna bolest.
Ako je detaljna reakcija aglutinacije postavljena za seroidifikaciju, tada se koriste aglutinirajući dijagnostički serumi, razrijeđeni do titra ili do polovine svog titra. RA se smatra pozitivnim ako se aglutinacija nađe u razrjeđenju bliskom dijagnostičkom titru seruma.
u mikrobiologiji
"Reakcija aglutinacije i njeni tipovi (RA)"
Plan:
1. Uvod…………………………………………………………………………………………………..3
2. RA na staklu……………………………………………………………………………………….4
3. PA epruveta…………………………………………………………………………………………….5
4. Korištena literatura………………………………………………………………………..7
1. Uvod.
Interakcija mikrobnog antigena i antitijela je strogo specifična i usmjerena je u životinjskom tijelu na neutralizaciju patogena i njegovih toksina. Interakcija antigena i antitijela in vitro pod određenim uvjetima praćena je vidljivim pojavama (aglutinacija, precipitacija, imunološka liza), što omogućava korištenje AG-AT reakcija, koje se nazivaju serološke (od latinskog serum-serum), u praktične svrhe. Biofabrike proizvode antigene i imunološke serume (antitijela) poznatog specifičnog smjera (dijagnostički). Uz pomoć takvih seruma u serološkim reakcijama moguće je identificirati nepoznati mikroorganizam ili pomoću poznatog antigena otkriti antitijela u tijelu sintetizirana kao odgovor na unošenje patogena, te na taj način postaviti dijagnozu (serološka dijagnoza) . Osim toga, serološke reakcije se mogu koristiti za procjenu intenziteta imunološkog odgovora nakon vakcinacije ili zarazne bolesti.
Reakcije aglutinacije, kao što su indirektna aglutinacija i Coombs, zasnivaju se na in vitro interakciji korpuskularnih antigena s antitijelima i sposobnosti nastalih kompleksa da se talože. Kao korpuskularni antigeni koriste se bakterijske ćelije ili rastvorljivi antigeni ekstrahovani iz mikroorganizama i adsorbovani na korpukulama nosača: eritrociti, čestice lateksa itd.
Antigenske determinante korpuskularnih antigena specifično interaguju sa homolognim antitelima (specifična, nevidljiva faza reakcije), a zatim kompleksi antigen-antitelo formiraju velike, golim okom vidljive konglomerate koji talože - aglutiniraju (nespecifična, vidljiva faza reakcije) . Kod ne-flageliranih oblika mikroba (Brucella) nastaju zrnasti aglutinanti, kod flagela (Escherichia, Salmonella) - veliki pamuk, koji se talože na dno epruvete u obliku obrnutog kišobrana i lako se lome pri protresanju. . Antigeni i antitela međusobno deluju samo u prisustvu elektrolita (u 0,8% rastvoru natrijum hlorida). Na tok reakcije utiču koncentracija soli u elektrolitu, broj mikrobnih ćelija u suspenziji, koncentracija u serumu, pH, temperatura i drugi faktori.
Reakcija aglutinacije (ra).
Razlikovati specifičnu aglutinaciju, roj se zasniva na interakciji antigena With homologno antitelo , sadržan u tijelu životinje, Krom je uveden ovaj antigen (imunoaglutinacija); nespecifične (kemijske), koje proizlaze iz promjena pH okoline, koncentracije elektrolita; spontana, to-ruyu se opaža kada se bakterije (koje su u R-obliku) suspenduju u fiziološkom rastvoru i kada se zagreju, što je povezano sa promjenom koloidnog stanja bakterijske ćelije. Antigen , uključen u RA naziva se aglutinogen, antitijelo se naziva aglutinin, a rezultujući precipitat se naziva aglutinat. U formiranju aglutinata bitan je kvantitativni odnos antigena i antitela (optimalni fenomen). Sa viškom ili nedostatkom antitijela, A.
Reakcija aglutinacije (RA) je jedna od prvih imunoloških reakcija koja se koristi u mikrobiološkoj praksi. Po prvi put (1895) F. Vidal je koristio RA za dijagnozu trbušnog tifusa. Kasnije (1897), A. Wright je koristio istu reakciju da dijagnosticira brucelozu kod ljudi. RA je također pronašao primjenu u dijagnostici puloroze pilića, leptospiroze, infektivnog pobačaja kobila, kao i za tipizaciju nepoznatih kultura mikroba prema poznatom aglutinirajućem serumu. RA je vrlo osjetljiv; može otkriti 0,01 µg azota proteina antitijela u 1 ml.
Razvijeno je nekoliko varijanti reakcije aglutinacije, koje se razlikuju po metodološkoj implementaciji i svrsi studije.
2. Ra na staklu.
Kod ove varijante RA mogu se testirati i serum i antigen, ali se ova varijanta najčešće koristi za identifikaciju mikroorganizama.
1. Za identifikaciju mikroorganizma (m/o), kap poznatog aglutinirajućeg seruma, kao što je salmonelioza, i kap fiziološkog rastvora (kontrola) se nanose odvojeno na odmašćeno staklo. Zatim se bakteriološkom petljom bakterijska masa proučavane kulture uzima iz kolonije u Petrijevoj zdjelici ili s površine kosog MPA u epruveti i odvojeno suspendira u imunološkom serumu i fiziološkoj otopini dok se ne dobije homogena suspenzija. . Rezultat se uzima u obzir nakon 2 ... 4 minute.
Obračun rezultata: ne bi trebalo biti promjena u kontrolnom uzorku. Uz specifičnu korespondenciju bakterijske kulture sa imunološkim serumom, pojavljuju se ljuspice aglutinata (pozitivan rezultat), u odsustvu fenomena aglutinacije, zaključuje se da proučavana bakterijska kultura ne odgovara imunološkom serumu.
2. Detekcija antitijela u ispitivanom krvnom serumu razmatrat će se na primjeru rose-bengal testa koji se koristi u serodijagnostici bruceloze. 0,3 ml ispitivanog životinjskog krvnog seruma i 0,03 ml antigena brucele (ćelije brucele obojene ružičastom bengalkom) se nanose na staklo. Komponente se temeljito promiješaju protresanjem čaše i rezultat se uzima u obzir nakon 4 minute.
Računovodstveni rezultati: uz pozitivnu reakciju pojavljuju se ružičaste ljuspice aglutinata. Serološka reakcija ove vrste klasificira se kao kvalitativna, jer se može koristiti za otkrivanje antitijela na patogen u krvnom serumu životinje, ali je nemoguće procijeniti njihov kvantitativni sadržaj.
/ 50
Najgore Najbolji
U tim reakcijama učestvuju antigeni u obliku čestica (mikrobne ćelije, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni), koji se spajaju sa antitijelima i talože.
U zavisnosti od vrste imunodijagnostikuma koji se koristi, javljaju se reakcije mikrobne aglutinacije, hemaglutinacije, lateks aglutinacije, koaglutinacije itd.
Za dijagnozu zaraznih bolesti, reakcija aglutinacije se provodi u dva smjera: tip patogena izoliranog od pacijenta određuje se dijagnostičkim aglutinirajućim serumom (serološka identifikacija mikroba), a specifična antitijela se detektiraju u serumu pacijenta pomoću standarda. mikrobna dijagnostika (serodijagnostika bolesti, serološka dijagnoza).
Razlikovati direktne i indirektne reakcije aglutinacije
Reakcija direktne aglutinacije mikroba (RA). U ovoj reakciji, antitijela (aglutinini) direktno aglutiniraju korpuskularne antigene (aglutanogene). Obično su predstavljeni suspenzijom inaktiviranih mikroorganizama (reakcija mikrobne aglutinacije). Prema prirodi nastalog aglutinata razlikuju se granularna i ljuskasta aglutinacija. Granularna aglutinacija nastaje kada se mikrobi koji sadrže O-antigen drže zajedno. Bakterije koje imaju flagelu (H-antigen) se aglutiniraju i formiraju velike pahuljice.
Za određivanje vrste mikroorganizama koriste se standardni dijagnostički aglutinirajući serumi. Dobivaju se hiperimunizacijom laboratorijskih životinja suspenzijom bakterija. Titar takvog seruma je njegovo najveće razrjeđenje, pri kojem se opaža izrazita aglutinacija odgovarajućeg antigena. Međutim, zbog složenosti antigenske strukture bakterija, aglutinirajući serumi sadrže antitijela ne samo na specifične, već i na grupne antigene i mogu dati grupnu aglutinaciju sa srodnim vrstama bakterija. Titri antitela u serumu na antigene specifične za vrstu uvek su veći od onih na antigene grupe. Za uklanjanje grupno-specifičnih antitijela, mikroorganizmi koji sadrže grupne antigene se uzastopno dodaju u serum (Castellani metoda). Ova metoda se koristi za dobivanje adsorbiranih seruma, koji sadrže antitijela na određenu vrstu mikroba.
Metode reakcija aglutinacije. Najčešći su lamelarni (indikativni) i raspoređeni RA. Lamelarni RA se postavlja na staklo. U ovoj reakciji koriste se serumi s blago razrijeđenim ili nerazrijeđenim. Koristi se kao ubrzana metoda za detekciju antitijela ili identifikaciju mikroorganizama. Na staklo se nanese kap seruma u koju se petljom unese nepoznata kultura bakterija, promiješa se i nakon 2-3 minute uočava se pojava sitnozrnate ili ljuskaste aglutinacije. Za kontrolu se koristi kap fiziološke otopine u kojoj se nakon unošenja bakterija uočava zamućenost. Kada koristite neadsorbirane serume, reakcija na stakalcu je samo smjernica.
Prošireni RA se izvodi u epruvetama ili pločama. U tom slučaju, dijagnostički serum se razrijedi do titra i dodaju jednake količine antigena. Ako je rezultat pozitivan, na dnu epruvete se formira labav talog u obliku "kišobrana", a ako je rezultat negativan, formira se talog u obliku "dugme". Budući da su titri grupno-specifičnih antitijela u serumu mnogo niži od titara specifičnih za vrstu, grupne reakcije se uočavaju samo u malim razrjeđenjima seruma. Ako se aglutinacija dogodi do titra ili do polovine titra seruma, to je specifično za vrstu.
Za određivanje antitijela u serumu pacijenta (serološka dijagnoza) koristi se standardni mikrobni dijagnostikum koji sadrži suspenziju poznatih mikroba ili njihovih antigena. U ovom slučaju je također moguće ugraditi ploču i raspoređeni RA.
Reakcija direktne aglutinacije ćelija. Za određivanje krvnih grupa koriste se standardni serumi krvi donora koji sadrže poznata anti-A ili anti-B antitijela. Reakcije se postavljaju na staklo ili ploče. U prisustvu A (2. krvna grupa), B (3. krvna grupa) ili oba antigena (4. krvna grupa) na eritrocitima, odgovarajući serumi aglutiniraju eritrocite. Također se koristi i test kompatibilnosti krvi, kada se pomiješaju kapi krvi davaoca i primatelja i procjenjuje se aglutinacija.
U klinikama se reakcija aglutinacije leukocita, trombocita i drugih stanica koristi za otkrivanje autoantitijela, kao i za određivanje antigena na tim stanicama.
Reakcija indirektne (pasivne) aglutinacije. Da bi se dobio fenomen aglutinacije, antigen se prethodno adsorbuje na korpuskularnom nosaču, a to su inertne čestice (lateks, celuloza, polistiren, barijum oksid itd.) ili ćelije (ovčiji eritrociti, I (0) -ljudske krvne grupe).
U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA), eritrociti se koriste kao nosač. Antigenom napunjeni eritrociti se drže zajedno u prisustvu specifičnih antitela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPGA kao dijagnostici antigena eritrocita za detekciju antitijela (serodijagnostika, serološka dijagnoza). Ako napunite crvena krvna zrnca antitijelima, ona se mogu koristiti za otkrivanje antigena.
Direktna i indirektna antiimunoglobulinska Coombsova reakcija. Koristi se za otkrivanje "nepotpunih" (neaglutinirajućih) antitijela koja se formiraju tokom razne bolesti: rezus konflikt, autoimune bolesti, neke infekcije. Za uspostavljanje ovih reakcija potreban je antiglobulinski serum koji se dobija imunizacijom zeca humanim imunoglobulinima. Takav serum sadrži kompletna (bivalentna) antitijela-antiimunoglobuline.
Direktna reakcija: u isprane eritrocite krvi pacijenta dodaje se antiimunoglobulinski serum. Ako postoje nekompletna antitijela (imunoglobulini) na eritrocitima, što se uočava kada hemolitička anemija, Rh-konflikt (eritrociti fetusa), oni su aglutinirani.
Indirektna reakcija otkriva slobodna antieritrocitna antitijela u krvnom serumu pacijenta. Ovom serumu se dodaju isprani eritrociti davaoca 0(I) krvne grupe. Smjesa je inkubirana na 37°C 30 minuta i eritrociti su isprani. Zatim im se dodaje antiimunoglobulinski serum. Ako u serumu pacijenta postoje nepotpuna antieritrocitna antitijela, dolazi do aglutinacije.
U tim reakcijama učestvuju antigeni u obliku čestica (mikrobne ćelije, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni), koji se spajaju sa antitijelima i talože.
Za uspostavljanje reakcije aglutinacije(RA) zahteva tri komponente: 1) antigen (aglutinogen);
2) antitelo (aglutinin)
3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Približni, ili lamelarni, RA se stavlja na stakalce na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, kap seruma u razrjeđenju 1:10 - 1:20 i kontrolna kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se odvojeno na staklo pomoću Pasteurove pipete. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obe bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir za nekoliko minuta vizuelno, ponekad i sa lupom (x5). Kod pozitivnog RA u kapi sa serumom uočava se pojava velikih i malih ljuskica, kod negativnog RA serum ostaje ravnomjerno zamućen.
Rice. 2. Približna reakcija aglutinacije.
Produžena reakcija aglutinacije kako bi se utvrdio titar specifičnih antitijela kod pacijenta.
Prošireni RA za serodijagnostiku stavlja se u serum pacijenata. Razrijeđen je u izotoničnoj otopini natrijum hlorida od 1:50 - 1:100 do 1:800 ili 1:1600. Budući da niži titri seruma mogu sadržavati normalne aglutinine koji su prisutni u zdravi ljudi ili pacijenti sa drugom dijagnozom (dijagnostički titar). Kao antigen u ovoj reakciji koriste se dijagnostikumi - poznate suspenzije, po pravilu, ubijenih bakterija.
U epruvete za aglutinaciju prethodno se sipa 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida. Prvom se dodaje 1 ml seruma razrijeđenog 1:100, a nakon miješanja 1 ml se prebacuje u drugi, iz drugog u treći itd. U rezultirajućim dvostrukim razrjeđenjima seruma (od 1:100 do 1:1600 ili više), dodaju se 1-2 kapi suspenzije bakterija koja sadrži 3 milijarde mikrobnih tijela po 1 ml. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C 2 sata, a zatim drže na sobnoj temperaturi jedan dan.
Obračun reakcije ekspandirane aglutinacije vrši se ocjenjivanjem svake epruvete uzastopno, počevši od kontrolnih, uz lagano mućkanje. U kontrolnim epruvetama ne bi trebalo biti aglutinacije. Intenzitet reakcije aglutinacije označen je sledećim znacima: ++++ - potpuna aglutinacija (ljuspice aglutinata u apsolutno providnoj tečnosti); +++ - nepotpuna aglutinacija (ljuspice u blago opalescentnoj tečnosti); ++ - djelomična aglutinacija (ljuspice su jasno vidljive, tečnost je blago zamućena); + - slaba, sumnjiva aglutinacija - tekućina je vrlo mutna, ljuspice u njoj se slabo razlikuju; - - nedostatak aglutinacije (tečnost je ravnomerno zamućena).
Titar seruma se uzima kao njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se intenzitet aglutinacije procjenjuje na najmanje dva plusa (++)
Rice. 7. Produžena reakcija aglutinacije.
Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RNHA, RPHA)
Reakcija je postavljena:
1) za otkrivanje polisaharida, proteina, ekstrakata bakterija i drugih visoko dispergiranih supstanci, rikecija i virusa, čiji se kompleksi sa aglutininima ne mogu vidjeti kod konvencionalnog RA,
2) detektovati antitela u serumu pacijenata na ove visoko dispergovane supstance i najsitnije mikroorganizme.
Pod indirektnom ili pasivnom aglutinacijom podrazumijeva se reakcija u kojoj antitijela stupaju u interakciju s antigenima koji su prethodno adsorbirani na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. ili ovnovi eritrociti, I (0) -ljudske krvne grupe)
U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA) kao nosač se koristi eritrociti. Antigenom napunjeni eritrociti se drže zajedno u prisustvu specifičnih antitela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPHA kao dijagnostikum eritrocita za detekciju antitijela (serodijagnostika). Ako su eritrociti napunjeni antitijelima (dijagnostikum eritrocitnih antitijela), onda se može koristiti za otkrivanje antigena.
Rice. 3. Šema RPGA: eritrociti (1), napunjeni antigenom (3), vezani su specifičnim antitelima (4).
inscenacija. U jamicama polistirenskih tableta pripremite seriju serijskih razrjeđenja seruma. U pretposljednju jažicu unesite - 0,5 ml poznatog pozitivnog seruma iu posljednje 0,5 ml fiziološkog rastvora (kontrole). Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razblaženog eritrocitnog dijagnostikuma, promućka i stavi u termostat na 2 sata.
Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, eritrociti se talože na dnu rupe u obliku ravnomjernog sloja ćelija sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom slučaju se talože u obliku gumba ili prstena. .
Fig.4. Računovodstvo RNGA (RPGA).
Obračunavanje rezultata RNHA, postavljenih za otkrivanje botulinum toksina.
Uzročnik botulizma - Clostridium botulinum proizvodi toksine sedam serovara (A, B, C, D, E, F, G), ali su serovari A, B, E češći od ostalih. Svi toksini se razlikuju po antigenskim svojstvima i mogu biti diferencirani u reakcijama prema tipu specifičnim serumima. U tu svrhu može se izvesti pasivna (indirektna) reakcija hemaglutinacije sa serumom pacijenta, u kojem se očekuje prisustvo toksina, i sa eritrocitima napunjenim antitijelima antitoksičnih antibotulinum seruma tipa A, B, E. Normalno. serum služi kao kontrola.
Rice. 3. Izjava i rezultat RNGA.
Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, eritrociti se talože na dnu rupe u obliku ravnomjernog sloja ćelija sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom slučaju se talože u obliku gumba ili prstena. .
Zaključak: U serumu pacijenta je pronađen botulinum toksin tipa E.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA).
Rice. 8. Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) (šema).
Princip reakcije zasniva se na sposobnosti AT da veže različite viruse i neutrališe ih, čime onemogućava aglutinaciju eritrocita. Vizuelno, ovaj efekat se manifestuje u "inhibiciji" hemaglutinacije. U dijagnostici se koristi RTGA virusne infekcije identificirati specifične antihemaglutinine i identificirati različite viruse po njihovim hemaglutininima, koji pokazuju svojstva Ag.
Tipizacija virusa se vrši u RTGA reakciji sa setom seruma specifičnih za tip. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir odsustvom hemaglutinacije. Podtipovi virusa tipa A sa antigenima H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 i drugim mogu se diferencirati u RTGA sa setom homolognih seruma specifičnih za tip
Rice. 9. Rezultati RTGA tokom tipizacije virusa gripa
Simboli: - inhibicija hemaglutinacije (dugme); - hemaglutinacija (kišobran).
Zaključci: Ispitni materijal sadrži virus gripa tipa A sa H3N2 antigenom.
IMUNOMIKROBIOLOŠKE STUDIJE
Imunološke metode se koriste za rješavanje mnogih problema:
1. Procjena stanja imunološki sistem ljudski (imuni status) određivanjem kvantitativnog i funkcionalne karakteristikećelije imunog sistema i njihovi proizvodi.
2. Određivanje sastava i karakteristika ljudskih tkiva: krvne grupe, Rh faktor, transplantacijski antigeni.
3. Dijagnostika zaraznih bolesti i rezistencije na njih detekcijom i određivanjem titra antitela (serodijagnostika), detekcija antigena patogena u organizmu, određivanje ćelijskih reakcija na ove antigene.
4. Seroididentifikacija kultura bakterija i virusa izolovanih iz ljudskih i životinjskih organizama.
5. Detekcija u ljudskom tijelu i okolini bilo kakvih supstanci koje imaju antigena ili haptička svojstva (hormoni, enzimi, otrovi, lijekovi, lijekovi itd.).
6. Identifikacija imunopatoloških stanja, alergija, transplantacijskih i antitumorskih reakcija.
Proces interakcije između antigena i antitijela u serološkim reakcijama odvija se u dvije faze:
1) specifično- faza interakcije, u kojoj dolazi do komplementarnog povezivanja aktivnih centara antitijela (paratopa) i epitopa antigena. Ova faza obično traje nekoliko sekundi ili minuta;
2) nespecifične- faza ispoljavanja, okarakterisana spoljni znaci formiranje imunoloških kompleksa. Ova faza se može razviti od nekoliko minuta do nekoliko sati.
Optimalna specifična interakcija antitijela s antigenom javlja se u izotoničnoj otopini s pH blizu neutralnog. Reakcija antigen-antitelo u in vitro sistemu može biti praćena sa nekoliko fenomena.
aglutinacija,
padavine,
liza.
Vanjske manifestacije reakcije zavise od fizička i hemijska svojstva antigen (veličina čestica, fizičko stanje), klasa i tip antitela (potpuna i nepotpuna), kao i eksperimentalni uslovi (srednja konzistencija, koncentracija soli, pH, temperatura).
Polivalentnost antigena i antitijela osigurava pojavu agregata vidljivih golim okom. To se događa u skladu s teorijom formiranja mreže, prema kojoj su drugi molekuli antitijela i antigena sekvencijalno vezani za nastali kompleks antigen-antitijelo. Kao rezultat, formiraju se mrežne strukture koje se pretvaraju u agregate koji se talože. Priroda i težina reakcije zavise od kvantitativnog omjera antigena i antitijela. Reakcije su najintenzivnije kada su reaktanti u ekvivalentnom omjeru.
Neophodan uslov formiranje rešetke (mreža) - prisustvo više od tri antigenske determinante za svaki molekul antigena i dva aktivna centra za svaki molekul antitijela. Molekuli antigena su rešetkasti čvorovi, a molekuli antitela su veze. Područje optimalnih omjera (zona ekvivalencije) koncentracija antigena i antitijela, kada se u supernatantu nakon formiranja precipitata ne otkrivaju ni slobodni antigeni ni slobodna antitijela.
Agregati sposobni za precipitaciju nastaju kada se antigeni kombinuju sa kompletnim antitelima. Nepotpuna antitijela (monovalentna) ne uzrokuju stvaranje mrežnih struktura i velikih agregata. Za otkrivanje takvih antitijela koriste se posebne metode zasnovane na upotrebi antiglobulina (Coombsova reakcija).
Serološke reakcije, zbog svoje visoke specifičnosti i osjetljivosti, koriste se za otkrivanje i kvantificiranje antigena i antitijela. Broj imunoreagensa u reakcijama izražava se titrom - maksimalnim razrjeđenjem seruma ili antigena, pri kojem se reakcija još uvijek opaža.
Serološke reakcije u mikrobiološkim i imunološkim laboratorijama koriste se u dvije svrhe:
1) za seroidifikaciju mikroorganizama, toksina, antigena uopšte pomoću poznatog antitela (imuno dijagnostički serum),
2) za serodijagnostiku - utvrđivanje prirode antitijela u krvnom serumu pacijenta u slučaju bakterijskih, virusnih, rjeđe drugih zarazne bolesti upotrebom poznatog antigena (diagnosticum).
Za određivanje generičkog, vrste i tipa antigena potrebni su poznati imunološki dijagnostički serumi. Dobivaju se ponovnim davanjem životinjama (često zečevima) u sve većim dozama ubijenih ili živih mikroorganizama, produkata njihovog raspadanja, neutraliziranih ili nativnih toksina. Nakon određenog ciklusa imunizacije životinja, vrši se masovno puštanje krvi ili totalno krvarenje životinje. Krv prikupljena u sterilnu posudu prvo se stavlja u termostat na 37°C na 4-6 sati da se ubrza zgrušavanje, a zatim u glečer na jedan dan. Dobijeni prozirni serum se aspirira u sterilnu posudu, dodaju se konzervansi, odredi titar antitijela, testira se sterilnost i sipa u ampule.
Koriste se neadsorbovan I adsorbovan dijagnostički serumi. Neadsorbirani serumi imaju visoke titre antitijela, ali su sposobni proizvesti grupne (unakrsne) reakcije.
Adsorbirani serumi se odlikuju strogom specifičnošću djelovanja (reaguju samo sa homolognim antigenom). Serum koji sadrži antitijela samo na jedan specifični antigen naziva se monoreceptor.
Takođe proizvode serume označene fluorohromima, enzimima, radioizotopima, koji dozvoljavaju visok stepen preciznost za otkrivanje čak i tragova antigena.
Kao antigeni (dijagnostikumi) u serološkim reakcijama koriste se suspenzije živih ili ubijenih bakterija, produkti njihovog cijepanja, toksini i virusi. U nekim slučajevima se koriste ekstrakti ili hemijski izolovani antigeni iz mikroorganizama i životinjskih tkiva.
Sve imunomikrobiološke metode mogu se podijeliti u 3 grupe:
1) na osnovu direktna interakcija antigena sa antitijelom(fenomeni aglutinacije, precipitacije, hemaglutinacije, imobilizacije, itd.);
2) na osnovu posredovana interakcija antigen-antitelo(reakcije indirektne hemaglutinacije, koaglutinacije, lateks aglutinacije, aglomeracije uglja, bentonitne aglutinacije, fiksacije komplementa itd.);
3) korišćenje obeležena antitela ili antigeni(metoda fluorescentnih antitijela, enzimski imunotest i radioimunotest i druge metode).
REAKCIJE AGLUTINACIJE
U tim reakcijama učestvuju antigeni u obliku čestica (mikrobne ćelije, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni), koji se spajaju sa antitijelima i talože.
Za uspostavljanje reakcije aglutinacije(RA) zahteva tri komponente: 1) antigen (aglutinogen);
2) antitelo (aglutinin)
3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Približni, ili lamelarni, RA se stavlja na stakalce na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, kap seruma u razrjeđenju 1:10 - 1:20 i kontrolna kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se odvojeno na staklo pomoću Pasteurove pipete. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obe bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir za nekoliko minuta vizuelno, ponekad i sa lupom (x5). Kod pozitivnog RA u kapi sa serumom uočava se pojava velikih i malih ljuskica, kod negativnog RA serum ostaje ravnomjerno zamućen.
Produžena reakcija aglutinacije kako bi se utvrdio titar specifičnih antitijela kod pacijenta.
Prošireni RA za serodijagnostiku stavlja se u serum pacijenata. Također se razrjeđuje izotoničnom otopinom natrijum hlorida od 1:50 - 1:100 do 1:800 ili 1:1600. Budući da niži titari seruma mogu sadržavati normalne aglutinine koji su prisutni kod zdravih ljudi ili pacijenata s različitom dijagnozom (dijagnostički titar ). Kao antigen u ovoj reakciji koriste se dijagnostikumi - poznate suspenzije, po pravilu, ubijenih bakterija.
U epruvete za aglutinaciju prethodno se sipa 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida. Prvom se dodaje 1 ml seruma razrijeđenog 1:100, a nakon miješanja 1 ml se prebacuje u drugi, iz drugog u treći itd. U rezultirajućim dvostrukim razrjeđenjima seruma (od 1:100 do 1:1600 ili više), dodaju se 1-2 kapi suspenzije bakterija koja sadrži 3 milijarde mikrobnih tijela po 1 ml. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C 2 sata, a zatim drže na sobnoj temperaturi jedan dan.
Obračun reakcije ekspandirane aglutinacije vrši se ocjenjivanjem svake epruvete uzastopno, počevši od kontrolnih, uz lagano mućkanje. U kontrolnim epruvetama ne bi trebalo biti aglutinacije. Intenzitet reakcije aglutinacije označen je sledećim znacima: ++++ - potpuna aglutinacija (ljuspice aglutinata u apsolutno providnoj tečnosti); +++ - nepotpuna aglutinacija (ljuspice u blago opalescentnoj tečnosti); ++ - djelomična aglutinacija (ljuspice su jasno vidljive, tečnost je blago zamućena); + - slaba, sumnjiva aglutinacija - tekućina je vrlo mutna, ljuspice u njoj se slabo razlikuju; - - nedostatak aglutinacije (tečnost je ravnomerno zamućena).
Titar seruma se uzima kao njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se intenzitet aglutinacije procjenjuje na najmanje dva plusa (++)
