Aglütinasyon reaksiyonu mikrobiyolojisi. Aglütinasyon reaksiyonu (RA)

16. Ders

Sözlük

DOĞRUDAN - hemen yanında hiçbir şey olmadan, aşağıdaki bağlantılar olmadan.

DOLAYLI OLARAK– diğer hücreler aracılığıyla, doğrudan değil.

AZALT ≠ ARTIR (hücre aktivitesi).

REDDETMEK - kabul etmemek, reddetmek. Vücut nakledilen organı reddetti.

bağışıklık reaksiyonları.

Bağışıklık reaksiyonları, bir antijen ile bir antikorun veya bir antijen ile hassaslaştırılmış bir T-lenfositin spesifik etkileşiminin (bağlanmasının) reaksiyonlarıdır.

Bu reaksiyonlar in vitro (bir test tüpünde) ve in vivo (canlı bir organizmada) gerçekleşir.

Serum bu reaksiyonlarda yer alır, bu yüzden denir serolojik.

bağışıklık reaksiyonları için kullanılır bulaşıcı hastalıkların teşhisi. Bu durumda bilinmeyen bileşen, antijenin antikor ile etkileşiminin özgüllüğüne dayanan bilinen bileşen tarafından belirlenir. Eğer bilinen antikor, o zaman yapabilirsin bilinmeyen bir antijeni tanımlayın (tespit edin). Eğer bilinen antijen, o zaman mümkün bilinmeyen antikorları tespit etmek.

Böylece, bağışıklık reaksiyonları kullanılır:

1) için hastalıkların serolojik teşhisi (serodiagnosis) - bulaşıcı bir hastalığa (bilinen antijen) belirli bir nedensel ajana karşı antikorların hasta kişilerin kan serumunda tespiti; hasta bir kişinin kan serumunda herhangi bir patojene karşı antikorlar varsa, bu bulaşıcı hastalığa neden olan bu patojendir;

2) için mikropların serolojik tanımlaması (seroidentifikasyon) - immün teşhis serumları (bilinen antikorlar) kullanılarak hastalığa neden olan ajanın türünü belirlemek; antikorlar hasta bir kişiden izole edilen bir patojeni bağlarsa, bu mikrop, hayvanın aşılandığı mikropla aynıdır. alma bağışıklık teşhis serumu .

Bağışıklık reaksiyonları 2 aşamada ilerler:

1) belirli aşama- antikorun aktif merkezinin, antijen-antikor komplekslerinin oluşumu ile antijenin determinant grubu ile bağlanması; bu aşama hızlı ilerler, ancak görünür bir etkisi yoktur;

2) spesifik olmayan faz- dış görünüş görünür etki antijen-antikor etkileşimleri taslak(aglütinasyon) veya bulanıklık(yağış), izin verir Görmek eğitim antijen-antikor kompleksleri ve hakkında bir sonuca varmak uyma antijen ve antikor birbirine.

Bağışıklık tepkileri aglütinasyon reaksiyonu (RA), çökelme reaksiyonu (RP), komplement fiksasyon reaksiyonu (RCC).

Aglütinasyon reaksiyonu- bu, bir elektrolit varlığında antikorların etkisi altında mikrobiyal veya diğer hücrelerin (eritrositler) yapışması ve çökelmesidir. Reaksiyonun görünür etkisi (aglütinasyon fenomeni), adı verilen bir çökeltinin oluşumudur. aglutinasyon.

Bu reaksiyon için kullanılır serolojik teşhis Ve seri tanımlama. RA, serodiagnoz (hastaların kan serumundaki antikorların saptanması) amacıyla kullanılır. Tifo ve paratifoid(Vidal reaksiyon), bruselloz(Wright tepkisi), tularemi ve leptospirosis. RA seroidifikasyon (hastadan izole edilen patojen tipinin belirlenmesi) için kullanılır. bağırsak enfeksiyonları boğmaca, kolera ve benzeri.

Bileşenlerreaksiyonlar:

1 A antijen (aglütinojen) - bunlar bütün (yok edilmemiş) mikrobiyal veya diğer hücrelerdir ( tanecikli, çözünmez antijen). aglütinojenler- bu bir askıya alma canlı veya öldürdü mikrobiyal hücreler veya diğer hücreler. Antijenler bilinmeyen veya bilinen olabilir. Bilinmeyen bir aglütinojen, belirlenmesi gereken bir hastanın vücudundan izole edilen bir mikrobiyal kültürdür. bilinen antijen teşhis- teşhis ilacı - ölülerin askıya alınması mikroplar bilinen türler fizyolojik solüsyonda Bu süspansiyon puslu (opak)), Çünkü mikrobiyal hücreler çözülmez, bozulmadan kalır. Hastanın serumundaki bilinmeyen antikorları saptamak için bilinen bir aglütinojen kullanılacaktır.

2. Antikor (aglütinin)- kan serumunda bulunur. Antikorlar ayrıca bilinmeyen veya bilinen olabilir. Kan serumunda belirlenemeyen antikorların bulunması Hasta kişi. Bilinen antikorlar bulunur bağışıklık teşhis serumu, denilen aglutinasyon serumu. Serotanımlama için kullanılırlar, örn. bilinmeyen bir antijeni belirlemek için - bir tür mikrobiyal kültür.

3. Elektrolit- %0,9 sodyum klorür çözeltisi.

Bir tanı alın.

Agar slant üzerinde yetiştirilen bilinen bir türe ait bir patojenin saf kültürü (örneğin, tifoya neden olan ajan), 3-4 ml ile yıkanır. izotonik solüsyon, steril bir test tüpüne konur, mikropları bir şekilde öldürür (örneğin kaynatarak ve yoğunluğunu belirleyerek (1 ml'de 3 milyar mikrobiyal hücre olmalıdır). Mikrobiyal hücreler öldürülürse Yüksek sıcaklık, sonra O-diagnosticum (O-antigen) alırlar, ancak formalin ile tedavi edilirse H-diagnosticum (H-antijen) alırlar.

teşhis örnekleri: Salmonella Diagnostikum, Brusella Diagnostikum, Tularemia Diagnostikum.

Aglütinasyon serumlarının elde edilmesi.

Hayvanlara (genellikle tavşanlara) aralıklarla 5-7 kez artan dozlarda parenteral olarak mikrobiyal tanı maddeleri enjekte edilir ( hiperimmünizasyon yapmak) ve daha sonra teşhisin hazırlandığı mikroplara karşı antikorlar içeren kan serumları alınır. Bağışıklama O-diagnosticum ile gerçekleştirilirse, H-diagnosticum - H-aglütinasyon serumları ile ise O-aglütinasyon serumları (O-antikorları içerir) elde edilir.

Aglütinasyon serumları adsorbe edilmemiş veya yerli ve adsorbe edilmiş.

Adsorbe olmayan serum yakından ilişkili birkaç mikrobiyal türe karşı grup antikorları içerir.

Adsorbe serum bir mikrop tipinin bir veya daha fazla antijenine karşı antikorlar içerir. Seralar sadece bir antijene karşı antikor içeriyorsa, bunlara monoreseptör veya tek değerli birkaç antijene ise - grup adsorbe serum .

Aglütinasyon serum örnekleri:salmonella monoreseptör H-aglütinasyon serumu, adsorbe edilmiş salmonella grubu O-aglütinasyon serumu, anti-kolera O-aglütinasyon serumu, vb..

titre aglütinasyon serumu - antijenle aglütinasyon reaksiyonunun hala tespit edildiği en yüksek serum seyreltmesi (titre kandaki antikor miktarına bağlıdır: daha fazla antikor, daha yüksek serum titresi).

RA ayarlama yolları.

1. Yaklaşık (plaka) RA- cam üzerinde gerçekleştirilir. Bir cam slayta 2 damla serum ve 1 damla izotonik solüsyon uygulayın. Serum damlalarından birine ve bir damla izotonik solüsyona bir öze ile mikrobiyal kültür verilir ve karıştırılır. Damla izotonik solüsyon mikroplarla – antijen kontrolü, Bir damla mikropsuz serumlar – antikor kontrolü, Bir damla mikroplu serum – deneyim. Serum, kendisiyle karıştırılan mikrobiyal antijenlere karşılık gelen antikorlar içeriyorsa, antikorlar ve antijenler spesifik olarak birbirine bağlanacak ve 1-3 dakika sonra deney damlasında aglütinet pullar görünecektir. Antijen kontrolü bulanık ve antikor kontrolü açık olmalıdır. Reaksiyonun sonuçlarının muhasebeleştirilmesi, aglütinat pullarının ortaya çıkmasıyla gerçekleştirilir. . Pullar düşerse, reaksiyon pozitiftir, yani. bir antijen, bir antikora karşılık gelir ve bir antijen, bir antikoru tanımlamak için kullanılabilir veya bunun tersi de geçerlidir. Bulanıklık kalırsa, reaksiyon negatiftir.

2. Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonu - test tüplerinde gerçekleştirilmiştir. Önce hasta bir kişinin kan serumundan 1:50 ila 1:1600 oranında 2 kat dilüsyon hazırlanır. 6 test tüpüne 1 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi dökülür. Birinci test tüpüne 1:50 dilüsyonda 1 ml hasta kan serumu eklenir, karıştırılır ve 1:100 dilüsyon elde edilir, ardından 1 ml 1:100 dilüsyonda ikinci test tüpüne aktarılır ve 1:200 dilüsyon elde edilir vb. Antijen ve serumu kontrol etmek için iki test tüpü bırakılır. Serum kontrolüne sadece 1:50 seyreltilmiş serum eklenir, antijen kontrolüne sadece antijen eklenir. Diğer tüm tüplere 0,1 ml antijen -diagnostikum (O- veya H-) eklenir ve tüm tüpler 37°C'de 18-20 saat termostata yerleştirilir. Reaksiyon sonuçlarının muhasebesi, oluşan çökeltinin (aglütinat) doğasına, miktarına ve bulanıklık derecesine göre yapılır. Hesaplama, kontrollerde yalnızca aşağıdaki sonuçlarla gerçekleştirilir: serum kontrolü - şeffaf, antijen kontrolü - bulutlu. O-antikorları ince taneli bir çökelti verir. H-antikorları - iri taneli. Aglütinasyon reaksiyonunun hala görülebildiği son test tüpüne göre, set teşhis titresi.

serodiagnoz ile hastalıklar, sadece belirli bir patojene karşı spesifik antikorları tespit etmek değil, aynı zamanda sayılarını da belirlemek önemlidir, yani. böyle bir antikor titresi oluşturmak, Bu patojenin neden olduğu bir hastalığın varlığından ne zaman bahsedebiliriz? . Bu titre tanısal titre olarak adlandırılır.Örneğin, tifo ateşini teşhis etmek için, 1:400'lük bir antikor titresinin saptanması gerekir, ancak daha az olamaz. Hatta daha fazla doğru sonuçlar verir eşleştirilmiş serumlarda antikorlarda bir artışın saptanması. Hastanın serumu hastalık başlangıcında ve 3-5 gün ve üzeri günlerde alınır. Antikor titresi en az 4 kat artarsa ​​bundan bahsedebiliriz. mevcut hastalık

Serotanımlama için ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu ayarlanırsa, aglütinasyon tanısal serumlar kullanılır, bir titreye veya titrelerinin yarısına kadar seyreltilir. Tanısal serum titresine yakın bir dilüsyonda aglütinasyon bulunursa RA pozitif kabul edilir.

mikrobiyolojide

"Aglutinasyon reaksiyonu ve türleri (RA)"

Plan:

1. Giriş……………………………………………………………………………………..3

2. Cam üzerinde RA……………………………………………………………………………….4

3. Test tüpü PA……………………………………………………………………………….5

4. Kullanılan literatür……………………………………………………………………..7

1. Giriş.

Mikrobiyal antijen ve antikorların etkileşimi kesinlikle spesifiktir ve hayvan vücudunda patojeni ve toksinlerini nötralize etmeye yöneliktir. Antijen ve antikorların belirli koşullar altında in vitro etkileşimine, pratik amaçlar için serolojik (Latince serum-serumdan) adı verilen AG-AT reaksiyonlarının kullanılmasına izin veren görünür fenomenler (aglütinasyon, çökelme, immün lizis) eşlik eder. Biyo fabrikalar, belirli bir yönü bilinen (tanısal) antijenler ve bağışıklık serumları (antikorlar) üretir. Serolojik reaksiyonlarda bu tür serumların yardımıyla bilinmeyen bir mikroorganizmayı tanımlamak veya bilinen bir antijeni kullanarak vücutta bir patojenin girmesine yanıt olarak sentezlenen antikorları tespit etmek ve böylece bir teşhis (serolojik teşhis) yapmak mümkündür. Ek olarak, aşılama veya bulaşıcı bir hastalıktan sonra bağışıklık yanıtının yoğunluğunu değerlendirmek için serolojik reaksiyonlar kullanılabilir.

Dolaylı aglütinasyon ve Coombs gibi aglütinasyon reaksiyonları, korpüsküler antijenlerin antikorlarla in vitro etkileşimine ve ortaya çıkan komplekslerin çökelme yeteneğine dayanır. Eritrositler, lateks partikülleri, vb.

Tanecik antijenlerinin antijenik belirleyicileri, spesifik olarak homolog antikorlarla (reaksiyonun spesifik, görünmez fazı) etkileşime girer ve daha sonra antijen-antikor kompleksleri, çökelen - aglütine olan (reaksiyonun spesifik olmayan, görünür fazı) çıplak gözle görülebilen büyük konglomeralar oluşturur. Kamçılı olmayan mikrop formlarında (Brucella), test tüpünün dibine ters bir şemsiye şeklinde yerleşen ve sallandığında kolayca kırılan flagella'da (Escherichia, Salmonella) - büyük pamukta granüler aglütinantlar oluşur. Antijenler ve antikorlar yalnızca bir elektrolit varlığında (%0,8 sodyum klorür çözeltisinde) etkileşime girer. Reaksiyonun seyri, elektrolitteki tuz konsantrasyonu, süspansiyondaki mikrobiyal hücrelerin sayısı, serum konsantrasyonu, pH, sıcaklık ve diğer faktörlerden etkilenir.

Aglütinasyon reaksiyonu (ra).

Spesifik aglütinasyonu ayırt edin, sürü antijenin etkileşimine dayanır İle homolog antikor , hayvanın vücudunda bulunan bu antijen Krom'a verildi (immünoaglütinasyon); ortamın pH'ındaki, elektrolit konsantrasyonundaki değişikliklerden kaynaklanan spesifik olmayan (kimyasal); kendiliğinden, to-ruyu, bakteriler (R-formunda olan) salin içinde süspanse edildiğinde ve ısıtıldığında bakteri hücresinin koloidal durumundaki bir değişiklikle ilişkili olarak gözlenir. Antijen , RA'da yer alan aglütinojen, antikora aglütinin, oluşan çökeltiye aglütinat denir. Aglütinat oluşumunda antijen ve antikorların kantitatif oranı (optimum fenomen) önemlidir. Antikor fazlalığı veya eksikliği ile, A.

Aglütinasyon reaksiyonu (RA), mikrobiyolojik pratikte kullanılan ilk immünolojik reaksiyonlardan biridir. İlk kez (1895) F. Vidal tifo tanısı için RA kullandı. Daha sonra (1897), A. Wright aynı reaksiyonu insanlarda brusellozu teşhis etmek için kullandı. RA ayrıca tavuklarda pullorosis, leptospirosis, kısraklarda enfeksiyöz kürtaj tanısında ve ayrıca bilinen aglütinasyon serumuna göre bilinmeyen mikrop kültürlerinin tiplendirilmesinde uygulama bulmuştur. RA oldukça hassastır; 1 ml'de 0,01 µg antikor protein nitrojeni tespit edebilir.

Metodolojik uygulamada ve çalışmanın amacında farklılık gösteren aglütinasyon reaksiyonunun çeşitli varyantları geliştirilmiştir.

2. Cam üzerine Ra.

RA'nın bu varyantında hem serum hem de antijen test edilebilir, ancak bu varyant çoğunlukla mikroorganizmaların tanımlanması için kullanılır.

1. Mikroorganizmayı (m / o) tanımlamak için, yağı alınmış bir cam slayta ayrı ayrı salmoneliosis gibi bir damla bilinen aglütinasyon serumu ve bir damla salin solüsyonu (kontrol) uygulanır. Daha sonra, bir bakteriyolojik öze kullanılarak, çalışılan kültürün bakteri kütlesi, bir Petri kabındaki koloniden veya bir test tüpündeki eğimli MPA'nın yüzeyinden alınır ve homojen bir süspansiyon elde edilene kadar immün serum ve fizyolojik salin içinde ayrı ayrı süspanse edilir. Sonuç 2 ... 4 dakika sonra dikkate alınır.

Sonuçların muhasebesi: kontrol örneğinde herhangi bir değişiklik olmamalıdır. Bakteri kültürünün bağışıklık serumuna spesifik olarak karşılık gelmesiyle, aglütinat pulları ortaya çıkar (pozitif sonuç), aglütinasyon fenomeninin yokluğunda, incelenen bakteri kültürünün bağışıklık serumuna karşılık gelmediği sonucuna varılır.

2. Çalışılan kan serumundaki antikorların tespiti, bruselloz serodiagnozunda kullanılan rose-bengal testi örneği kullanılarak ele alınacaktır. 0.3 ml incelenen hayvan kan serumu ve 0.03 ml brusella antijeni (pembe Bengal ile boyanmış brusella hücreleri) bir cam slayta uygulanır. Bileşenler cam çalkalanarak iyice karıştırılır ve 4 dakika sonra sonuç dikkate alınır.

Hesaplama sonuçları: Pozitif bir reaksiyonla, pembe aglütinat pulları belirir. Bu tür bir serolojik reaksiyon, hayvanın kan serumundaki patojene karşı antikorları tespit etmek için kullanılabileceği, ancak bunların nicel içeriğini değerlendirmek imkansız olduğu için kalitatif olarak sınıflandırılır.

/ 50
En kötüsü En iyi

Parçacık şeklindeki antijenler (mikrobiyal hücreler, eritrositler ve diğer korpüsküler antijenler) bu reaksiyonlarda yer alır ve antikorlarla birbirine yapışarak çökelir.

Kullanılan immünodiagnostik türüne bağlı olarak, mikrobiyal aglütinasyon, hemaglütinasyon, lateks aglütinasyon, pıhtılaşma vb.

Bulaşıcı hastalıkların teşhisi için, aglütinasyon reaksiyonu iki yönde gerçekleştirilir: hastadan izole edilen patojenin tipi, tanısal aglütinasyon serumu (mikropun serolojik tanımlaması) kullanılarak belirlenir ve standart mikrobiyal tanı (hastalığın serolojik teşhisi, serolojik teşhis) kullanılarak hastanın serumunda spesifik antikorlar tespit edilir.

Doğrudan ve dolaylı aglütinasyon reaksiyonlarını ayırt eder

Mikropların (RA) doğrudan aglütinasyon reaksiyonu. Bu reaksiyonda, antikorlar (aglütininler) doğrudan korpüsküler antijenleri (aglutanojenler) aglütine eder. Genellikle inaktive edilmiş mikroorganizmaların bir süspansiyonu (mikrobiyal aglütinasyon reaksiyonu) ile temsil edilirler. Elde edilen aglütinatın doğasına göre granüler ve pul pul aglütinasyon ayırt edilir. Granüler aglütinasyon, O-antijeni içeren mikroplar birbirine yapıştığında meydana gelir. Flagella'ya (H-antijeni) sahip bakteriler, büyük pullar oluşturmak için aglütine olur.

Mikroorganizmaların türünü belirlemek için standart tanısal aglütinasyon serumları kullanılır. Laboratuar hayvanlarının bir bakteri süspansiyonu ile hiperimmünizasyonuyla elde edilirler. Bu tür serumun titresi, karşılık gelen antijenin belirgin bir aglütinasyonunun gözlendiği en yüksek dilüsyondur. Bununla birlikte, bakterilerin antijenik yapısının karmaşıklığı nedeniyle aglütinasyon yapan serumlar, yalnızca türe özgü değil, aynı zamanda grup antijenlerine karşı da antikorlar içerir ve ilgili bakteri türleri ile grup aglütinasyonu sağlayabilir. Türe özgü antijenlere yönelik serum antikor titreleri her zaman grup antijenlerine göre daha yüksektir. Gruba özgü antikorları uzaklaştırmak için grup antijenlerini içeren mikroorganizmalar sırayla seruma eklenir (Castellani yöntemi). Bu yöntem, belirli bir mikrop türüne karşı antikorlar içeren adsorbe edilmiş serumlar elde etmek için kullanılır.

Aglütinasyon reaksiyon yöntemleri. En yaygın olanları katmanlı (gösterge niteliğinde) ve konuşlandırılmış RA'dır. Lamellar RA cam üzerine yerleştirilir. Bu reaksiyonda hafif seyreltilmiş veya seyreltilmemiş serumlar kullanılır. Antikorları tespit etmek veya mikroorganizmaları tanımlamak için hızlandırılmış bir yöntem olarak kullanılır. İçine bilinmeyen bir bakteri kültürünün bir öze ile sokulduğu bardağa bir damla serum damlatılır, karıştırılır ve 2-3 dakika sonra ince taneli veya pul pul aglütinasyon görünümü gözlenir. Kontrol için, bakteri girişinden sonra bulanıklığın gözlendiği bir damla fizyolojik solüsyon kullanılır. Adsorbe edilmemiş serumlar kullanılırken, slayttaki reaksiyon yalnızca bir kılavuz niteliğindedir.

Genişletilmiş RA, test tüplerinde veya plaka kuyularında gerçekleştirilir. Bu durumda teşhis serumu bir titreye seyreltilir ve eşit miktarda antijen eklenir. Sonuç pozitif ise test tüpünün dibinde "şemsiye" şeklinde gevşek bir çökelti oluşur, sonuç negatifse "düğme" şeklinde bir çökelti oluşur. Gruba özgü antikorların serumdaki titreleri türe özgü olanlara göre çok daha düşük olduğundan grup reaksiyonları sadece küçük serum dilüsyonlarında gözlenir. Titrede veya serum titresinin yarısına kadar aglütinasyon oluşursa, bu türe özgüdür.

Hastanın serumundaki antikorları belirlemek için (serolojik teşhis), bilinen mikropların veya bunların antijenlerinin bir süspansiyonunu içeren standart bir mikrobiyal teşhis kullanılır. Bu durumda, bir plaka takmak ve RA yerleştirmek de mümkündür.

Hücrelerin doğrudan aglütinasyonu reaksiyonu. Kan gruplarını belirlemek için bilinen anti-A veya anti-B antikorlarını içeren standart donör kan serumları kullanılır. Reaksiyonlar cam veya tabaklara yerleştirilir. Eritrositler üzerinde A (2. kan grubu), B (3. kan grubu) veya her iki antijenin (4. kan grubu) varlığında, karşılık gelen sera eritrositleri aglutine eder. Bir donörden ve bir alıcıdan kan damlatıldığında ve aglütinasyon değerlendirildiğinde bir kan uyumluluğu testi de kullanılır.

Kliniklerde, lökositlerin, trombositlerin ve diğer hücrelerin aglütinasyon reaksiyonu, otoantikorları tespit etmek ve ayrıca bu hücreler üzerindeki antijenleri belirlemek için kullanılır.

Dolaylı (pasif) aglütinasyonun reaksiyonu. Aglütinasyon fenomenini elde etmek için, antijen ön olarak inert parçacıklar (lateks, selüloz, polistiren, baryum oksit, vb.) veya hücreler (koyun eritrositler, I (0) -insan kan grupları) olan bir korpüsküler taşıyıcı üzerine adsorbe edilir.

Pasif hemaglütinasyon reaksiyonunda (RPHA), eritrositler taşıyıcı olarak kullanılır. Antijen yüklü eritrositler, bu antijene spesifik antikorların varlığında birbirine yapışır ve çökelir. Antijene duyarlı eritrositler, RPGA'da antikorların saptanması için bir eritrosit antijen tanılayıcısı olarak kullanılır (serodiagnosis, serolojik tanı). Kırmızı kan hücrelerini antikorlarla yüklerseniz, antijenleri tespit etmek için kullanılabilirler.

Doğrudan ve dolaylı anti-immünoglobulin Coombs reaksiyonu. sırasında oluşan "eksik" (aglütine olmayan) antikorları tespit etmek için kullanılır. çeşitli hastalıklar: rhesus çatışması, otoimmün hastalıklar, bazı enfeksiyonlar. Bu reaksiyonları oluşturmak için, bir tavşana insan immünoglobülinleri aşılanarak elde edilen antiglobulin serumuna ihtiyaç vardır. Bu tür serum, tam (bivalent) antikorlar-antiimmunoglobulinler içerir.

Direkt reaksiyon: Hastanın kanının yıkanmış eritrositlerine anti-immünoglobulin serumu eklenir. Eritrositler üzerinde inkomplet antikorlar (immünoglobulinler) varsa, hemolitik anemi, Rh çatışması (fetüsün eritrositleri), aglütine olurlar.

Dolaylı bir reaksiyon, hastanın kan serumunda serbest anti-eritrosit antikorları ortaya çıkarır. 0(I) kan grubu donörünün yıkanmış eritrositleri bu seruma eklenir. Karışım 37°C'de 30 dakika inkübe edilir ve eritrositler yıkanır. Daha sonra bunlara anti-immünoglobulin serum eklenir. Hastanın serumunda eksik anti-eritrosit antikorları varsa aglütinasyon meydana gelir.

Parçacık şeklindeki antijenler (mikrobiyal hücreler, eritrositler ve diğer korpüsküler antijenler) bu reaksiyonlarda yer alır ve antikorlarla birbirine yapışarak çökelir.

Bir aglütinasyon reaksiyonu oluşturmak için(RA) üç bileşen gerektirir: 1) antijen (aglütinojen);

2) antikor (aglütinin)

3) elektrolit (izotonik sodyum klorür çözeltisi).

Yaklaşık aglütinasyon reaksiyonu (RA)

Yaklaşık veya katmanlı RA, oda sıcaklığında bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Bunu yapmak için, 1:10 - 1:20 oranında seyreltilmiş bir serum damlası ve bir kontrol damlası izotonik sodyum klorür çözeltisi, bir Pasteur pipeti ile bardağa ayrı ayrı uygulanır. Koloniler veya günlük bir bakteri kültürü (bir damla teşhis) her iki bakteriyolojik döngüye eklenir ve iyice karıştırılır. Tepkiler birkaç dakika içinde görsel olarak, bazen bir büyüteçle (x5) dikkate alınır. Serum damlasında pozitif RA ile, irili ufaklı pulların görünümü not edilir, negatif RA ile serum eşit şekilde bulanık kalır.

Pirinç. 2. Yaklaşık aglütinasyon reaksiyonu.

Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonu Bir hastadaki spesifik antikorların titresini belirlemek için.

Genişletilmiş RA serodiagnoz için hastaların serumlarına konur. 1:50 - 1:100'den 1:800 veya 1:1600'e kadar izotonik bir sodyum klorür solüsyonunda seyreltilir.Daha düşük serum titreleri, kanda bulunan normal aglütininleri içerebileceğinden sağlıklı insanlar veya başka bir teşhisi olan hastalar (teşhis titresi). Bu reaksiyonda bir antijen olarak, teşhis maddeleri kullanılır - kural olarak, öldürülmüş bakterilerin bilinen süspansiyonları.

Aglütinasyon tüplerine ön olarak 1 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi dökülür. Birincisine 1:100 seyreltilmiş 1 ml serum eklenir ve karıştırıldıktan sonra ikinciye, ikinciden üçüncüye vb. 1 ml aktarılır. Ortaya çıkan iki kat sera seyreltmelerinde (1:100'den 1:1600'e veya daha fazla), 1 ml'de 3 milyar mikrobiyal cisim içeren 1-2 damla bakteri süspansiyonu eklenir. Tüpler çalkalanarak 37°C'deki termostatta 2 saat bekletildikten sonra oda sıcaklığında bir gün bekletilir.

Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonunun muhasebeleştirilmesi, her bir test tüpünün, kontrol tüplerinden başlayarak, hafifçe çalkalanarak sırayla değerlendirilmesiyle gerçekleştirilir. Kontrol tüplerinde aglütinasyon olmamalıdır. Aglütinasyon reaksiyonunun yoğunluğu aşağıdaki işaretlerle işaretlenmiştir: ++++ - tam aglütinasyon (mutlak şeffaf bir sıvı içinde aglütinat pulları); +++ - eksik aglütinasyon (hafif yanardöner bir sıvıda pullar); ++ - kısmi aglütinasyon (pullar açıkça görülebilir, sıvı biraz bulanık); + - zayıf, şüpheli aglütinasyon - sıvı çok bulanık, içindeki pullar çok az ayırt edilebilir; - - aglütinasyon eksikliği (sıvı eşit derecede bulanıktır).

Aglütinasyon yoğunluğunun en az iki artı (++) olarak tahmin edildiği son seyreltme olarak serum titresi alınır.

Pirinç. 7. Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonu.

Dolaylı (pasif) hemaglütinasyonun (RNHA, RPHA) reaksiyonu

Reaksiyon ayarlandı:

1) aglütininlerle kompleksleri geleneksel RA'da görülemeyen polisakkaritleri, proteinleri, bakteri özlerini ve diğer yüksek oranda dağılmış maddeleri, riketsiyaları ve virüsleri tespit etmek,

2) hastaların serumlarında bu yüksek oranda dağılmış maddelere ve en küçük mikroorganizmalara karşı antikorları tespit etmek.

Dolaylı veya pasif aglütinasyon altında, antikorların daha önce inert partiküller (lateks, selüloz, polistiren, baryum oksit vb. veya ram eritrositler, I (0) -insan kan grupları) üzerinde adsorbe edilmiş antijenlerle etkileşime girdiği bir reaksiyon anlaşılır.

Pasif hemaglutinasyon reaksiyonunda (RPHA) taşıyıcı olarak kullanılır. eritrositler. Antijen yüklü eritrositler, bu antijene spesifik antikorların varlığında birbirine yapışır ve çökelir. Antijene duyarlı eritrositler, RPHA'da antikorların saptanması (serodiagnosis) için bir eritrosit tanılama aracı olarak kullanılır. Eritrositler antikorlarla (eritrosit antikor diagnostikum) yüklüyse, antijenleri saptamak için kullanılabilir.

Pirinç. 3. RPGA şeması: antijen (3) ile yüklü eritrositler (1), spesifik antikorlar (4) ile bağlanır.

sahneleme. Polistiren tabletlerin haznelerinde bir dizi seri serum seyreltisi hazırlanır. Sondan bir önceki kuyuya - 0,5 ml bilinen pozitif serum ve son 0,5 ml salin (kontroller) katkıda bulunur. Daha sonra tüm kuyucuklara 0,1 ml seyreltilmiş eritrosit diagnostik eklenir, çalkalanır ve 2 saat termostata konur.

Muhasebe. Olumlu bir durumda eritrositler, deliğin dibine katlanmış veya tırtıklı kenarlı (ters bir şemsiye) düz bir hücre tabakası şeklinde yerleşirler, olumsuz bir durumda ise bir düğme veya halka şeklinde yerleşirler.

Şekil 4. Muhasebe RNGA (RPGA).

Botulinum toksini saptamak üzere ayarlanan RNHA sonuçlarının hesaplanması.

Botulizmin etken maddesi - Clostridium botulinum yedi serovarın (A, B, C, D, E, F, G) toksinlerini üretir, ancak A, B, E serovarları diğerlerinden daha yaygındır.Tüm toksinler antijenik özelliklerde farklılık gösterir ve reaksiyonlarda tipe özgü serumlarla ayırt edilebilir. Bu amaçla, içinde toksin bulunması beklenen hasta serumu ve A, B, E tipi antitoksik anti-botulinum serumlarının antikorları ile yüklü eritrositlerle pasif (dolaylı) bir hemaglutinasyon reaksiyonu gerçekleştirilebilir. Normal serum kontrol görevi görür.

Pirinç. 3. RNGA'nın beyanı ve sonucu.

Muhasebe. Olumlu bir durumda eritrositler, deliğin dibine katlanmış veya tırtıklı kenarlı (ters bir şemsiye) düz bir hücre tabakası şeklinde yerleşirler, olumsuz bir durumda ise bir düğme veya halka şeklinde yerleşirler.

Sonuç: Hastanın serumunda botulinum toksini tip E bulundu.

Hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu (RTGA).

Pirinç. 8. Hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu (RTGA) (şema).

Reaksiyonun prensibi, AT'nin çeşitli virüsleri bağlama ve onları nötralize ederek eritrositlerin aglütine olmasını imkansız hale getirme yeteneğine dayanır. Görsel olarak, bu etki hemaglütinasyonun "inhibisyonunda" kendini gösterir. RTGA tanıda kullanılır viral enfeksiyonlar spesifik antihemaglutininleri tanımlamak ve Ag özelliklerini sergileyen hemaglutininleri ile çeşitli virüsleri tanımlamak için.

Virüs tiplemesi, tipe özgü bir dizi serum ile RTGA reaksiyonunda gerçekleştirilir. Reaksiyonun sonuçları, hemaglütinasyonun olmaması ile dikkate alınır. H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 ve diğer antijenlere sahip Tip A virüs alt tipleri, bir dizi homolog tipe özgü serum ile RTGA'da ayırt edilebilir

Pirinç. 9. İnfluenza virüsünün tiplendirilmesi sırasında RTGA sonuçları

Semboller: - hemaglütinasyonun inhibisyonu (düğme); - hemaglutinasyon (şemsiye).

Sonuçlar: Test materyali, H3N2 antijenli influenza tip A virüsü içerir.

İMMÜNOMİKROBİYOLOJİK ÇALIŞMALAR

İmmünolojik yöntemler birçok sorunu çözmek için kullanılır:

1. Durum değerlendirmesi bağışıklık sistemi insan (bağışıklık durumu) kantitatif olarak belirlenerek ve işlevsel özellikler bağışıklık sistemi hücreleri ve ürünleri.

2. İnsan dokularının bileşiminin ve özelliklerinin belirlenmesi: kan grupları, Rh faktörü, transplantasyon antijenleri.

3. Antikor titrelerinin saptanması ve belirlenmesi (serodiagnosis), vücuttaki patojenlerin antijenlerinin saptanması, bu antijenlere karşı hücresel reaksiyonların belirlenmesi yoluyla bulaşıcı hastalıkların teşhisi ve bunlara karşı direnç.

4. İnsan ve hayvan organizmalarından izole edilen bakteri ve virüs kültürlerinin seri tanımlanması.

5. İnsan vücudunda ve ortamda antijenik veya haptik özelliklere sahip herhangi bir maddenin (hormonlar, enzimler, zehirler, ilaçlar, ilaçlar vb.) tespiti.

6. İmmünopatolojik durumların, alerjilerin, transplantasyonun ve antitümör reaksiyonların tanımlanması.

Serolojik reaksiyonlarda antijen ve antikor arasındaki etkileşim süreci iki aşamada ilerler:

1) özel- aktif antikor merkezlerinin (paratoplar) ve antijen epitoplarının tamamlayıcı bağlantısının meydana geldiği etkileşim aşaması. Bu aşama genellikle birkaç saniye veya dakika sürer;

2) spesifik olmayan- karakterize edilen tezahür aşaması dışa dönük işaretler bağışıklık komplekslerinin oluşumu. Bu aşama birkaç dakikadan birkaç saate kadar gelişebilir.

Antikorların antijen ile optimum spesifik etkileşimi, nötre yakın bir pH'a sahip izotonik bir çözeltide gerçekleşir. İn vitro sistemdeki antijen-antikor reaksiyonuna birkaç fenomen eşlik edebilir.

aglütinasyon,

yağış,

lizis.

Reaksiyonun dış belirtileri şunlara bağlıdır: fiziksel ve kimyasal özellikler antijen (parçacık boyutu, fiziksel durum), antikor sınıfı ve tipi (tam ve eksik) ve ayrıca deney koşulları (orta tutarlılık, tuz konsantrasyonu, pH, sıcaklık).

Antijenlerin ve antikorların polivalansı, çıplak gözle görülebilen agregatların görünümünü sağlar. Bu, diğer antikor ve antijen moleküllerinin ortaya çıkan antijen-antikor kompleksine sırayla bağlandığı ağ oluşumu teorisine göre gerçekleşir. Sonuç olarak, çökelen agregalara dönüşen ağ yapıları oluşur. Reaksiyonun doğası ve şiddeti, antijenlerin ve antikorların kantitatif oranına bağlıdır. Reaksiyonlar, reaktanlar eşdeğer bir oranda olduğunda en yoğundur.

Gerekli kondisyon bir kafes (ağlar) oluşumu - her antijen molekülü için üçten fazla antijenik determinantın ve her antikor molekülü için iki aktif merkezin varlığı. Antijen molekülleri kafes düğümleridir ve antikor molekülleri bağlantı halkalarıdır. Bir çökelti oluşumundan sonra süpernatanda ne serbest antijenler ne de serbest antikorlar tespit edilmediğinde, antijen ve antikor konsantrasyonlarının optimal oranlarının (eşdeğerlik bölgesi) alanı.

Çökelebilen agregatlar, antijenler tam antikorlarla birleştirildiğinde oluşur. Eksik antikorlar (tek değerlikli), ağ yapılarının ve büyük agregaların oluşumuna neden olmaz. Bu tür antikorları tespit etmek için antiglobulinlerin (Coombs reaksiyonu) kullanımına dayalı özel yöntemler kullanılır.

Yüksek özgüllükleri ve duyarlılıkları nedeniyle serolojik reaksiyonlar, antijenleri ve antikorları saptamak ve ölçmek için kullanılır. Reaksiyonlardaki immünoreajanların sayısı titre ile ifade edilir - reaksiyonun hala gözlendiği maksimum serum veya antijen seyreltmesi.

Mikrobiyolojik ve immünolojik laboratuvarlarda serolojik reaksiyonlar iki amaçla kullanılmaktadır:

1) bilinen bir antikor (bağışıklık teşhis serumu) kullanılarak mikroorganizmaların, toksinlerin, genel olarak antijenin sero-tanımlanması için,

2) serodiagnoz için - bakteriyel, viral, daha az sıklıkla diğerleri durumunda hastanın kan serumundaki antikorun doğasının belirlenmesi bulaşıcı hastalıklar bilinen bir antijen (teşhis) kullanarak.

Bir antijenin jenerik, tür ve tipini belirlemek için bilinen immün teşhis serumları gereklidir. Hayvanlara (çoğunlukla tavşanlara) ölü veya canlı mikroorganizmaların, bunların bozunma ürünlerinin, nötralize veya doğal toksinlerin artan dozlarında tekrar tekrar uygulanmasıyla elde edilirler. Hayvanların belirli bir bağışıklık kazandırma döngüsünden sonra, hayvanın yoğun kanlanması veya tamamen kanaması gerçekleşir. Steril kapta toplanan kan, pıhtılaşmayı hızlandırmak için önce 37°C sıcaklıktaki termostatta 4-6 saat, ardından bir gün buzulda bekletilir. Elde edilen şeffaf serum steril bir kaba aspire edilir, koruyucular eklenir, antikor titresi belirlenir, sterilite testi yapılır ve ampullere dökülür.

Kullanılmış adsorbe edilmemiş Ve adsorbe edilmiş teşhis serumu. Adsorbe olmayan serumlar, yüksek antikor titrelerine sahiptir, ancak grup (çapraz) reaksiyonlar üretebilir.

Adsorbe edilmiş serumlar, kesin bir etki özgüllüğü ile karakterize edilir (yalnızca homolog bir antijenle reaksiyona girerler). Sadece bir spesifik antijene karşı antikor içeren serumlara denir. monoreseptör.

Ayrıca florokromlar, enzimler, radyoizotoplar ile etiketlenmiş seralar üretirler. yüksek derece antijenin izlerini bile tespit etme doğruluğu.

Serolojik reaksiyonlarda antijen (teşhis) olarak canlı veya öldürülmüş bakterilerin süspansiyonları, bunların parçalanma ürünleri, toksinler ve virüsler kullanılır. Bazı durumlarda, mikroorganizmalardan ve hayvan dokularından ekstraktlar veya kimyasal olarak izole edilmiş antijenler kullanılır.

Tüm immunomikrobiyolojik yöntemler 3 gruba ayrılabilir.:

1) dayalı antijenin antikorla doğrudan etkileşimi(aglütinasyon, çökelme, hemaglütinasyon, immobilizasyon, vb. fenomenleri);

2) dayalı aracılı antijen-antikor etkileşimi(dolaylı hemaglütinasyon, pıhtılaşma, lateks aglütinasyon, kömür aglomerasyonu, bentonit aglütinasyonu, tamamlayıcı fiksasyonu vb. reaksiyonları);

3) kullanarak etiketli antikorlar veya antijenler(flüoresan antikor yöntemi, enzim immün testi ve radyoimmüno testi ve diğer yöntemler).

AGLÜTİNASYON REAKSİYONLARI

Parçacık şeklindeki antijenler (mikrobiyal hücreler, eritrositler ve diğer korpüsküler antijenler) bu reaksiyonlarda yer alır ve antikorlarla birbirine yapışarak çökelir.

Bir aglütinasyon reaksiyonu oluşturmak için(RA) üç bileşen gerektirir: 1) antijen (aglütinojen);

2) antikor (aglütinin)

3) elektrolit (izotonik sodyum klorür çözeltisi).

Yaklaşık aglütinasyon reaksiyonu (RA)

Yaklaşık veya katmanlı RA, oda sıcaklığında bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Bunu yapmak için, 1:10 - 1:20 oranında seyreltilmiş bir serum damlası ve bir kontrol damlası izotonik sodyum klorür çözeltisi, bir Pasteur pipeti ile bardağa ayrı ayrı uygulanır. Koloniler veya günlük bir bakteri kültürü (bir damla teşhis) her iki bakteriyolojik döngüye eklenir ve iyice karıştırılır. Tepkiler birkaç dakika içinde görsel olarak, bazen bir büyüteçle (x5) dikkate alınır. Serum damlasında pozitif RA ile, irili ufaklı pulların görünümü not edilir, negatif RA ile serum eşit şekilde bulanık kalır.

Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonu Bir hastadaki spesifik antikorların titresini belirlemek için.

Genişletilmiş RA serodiagnoz için hastaların serumlarına konur. Ayrıca 1:50 - 1:100'den 1:800 veya 1:1600'e kadar bir izotonik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilir.Daha düşük serum titreleri, sağlıklı kişilerde veya farklı bir tanıya (teşhis titresi) sahip hastalarda bulunan normal aglütininleri içerebileceğinden. Bu reaksiyonda bir antijen olarak, teşhis maddeleri kullanılır - kural olarak, öldürülmüş bakterilerin bilinen süspansiyonları.

Aglütinasyon tüplerine ön olarak 1 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi dökülür. Birincisine 1:100 seyreltilmiş 1 ml serum eklenir ve karıştırıldıktan sonra ikinciye, ikinciden üçüncüye vb. 1 ml aktarılır. Ortaya çıkan iki kat sera seyreltmelerinde (1:100'den 1:1600'e veya daha fazla), 1 ml'de 3 milyar mikrobiyal cisim içeren 1-2 damla bakteri süspansiyonu eklenir. Tüpler çalkalanarak 37°C'deki termostatta 2 saat bekletildikten sonra oda sıcaklığında bir gün bekletilir.

Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonunun muhasebeleştirilmesi, her bir test tüpünün, kontrol tüplerinden başlayarak, hafifçe çalkalanarak sırayla değerlendirilmesiyle gerçekleştirilir. Kontrol tüplerinde aglütinasyon olmamalıdır. Aglütinasyon reaksiyonunun yoğunluğu aşağıdaki işaretlerle işaretlenmiştir: ++++ - tam aglütinasyon (mutlak şeffaf bir sıvı içinde aglütinat pulları); +++ - eksik aglütinasyon (hafif yanardöner bir sıvıda pullar); ++ - kısmi aglütinasyon (pullar açıkça görülebilir, sıvı biraz bulanık); + - zayıf, şüpheli aglütinasyon - sıvı çok bulanık, içindeki pullar çok az ayırt edilebilir; - - aglütinasyon eksikliği (sıvı eşit derecede bulanıktır).

Aglütinasyon yoğunluğunun en az iki artı (++) olarak tahmin edildiği son seyreltme olarak serum titresi alınır.