aglütinasyon aşamaları. Mikrobiyoloji dersi "Bağışıklık reaksiyonları

Aglütinasyon reaksiyonu

Aglütinasyon (lat. aglütinasyon- yapıştırma) - antijen taşıyan korpüsküler parçacıkların (tüm hücreler, lateks parçacıkları, vb.) elektrolitlerin varlığında spesifik antikor molekülleri ile yapıştırılması (bağlanması), bu, gözle görülebilen pul veya tortu (aglütinat) oluşumuyla sona erer. çıplak göz Sedimentin doğası, antijenin doğasına bağlıdır: kamçılı bakteriler büyük pul tortu verir, flagellar ve kapsülsüz - ince taneli, kapsüler - lifli. Spesifik antikorlarla etkileşimin doğrudan bir bakterinin kendi antijenlerini veya eritrositler gibi başka herhangi bir hücreyi içerdiği doğrudan aglütinasyonu ayırt edin; ve dolaylı veya pasif, burada bakteri hücreleri veya eritrositler veya lateks partikülleri kendilerinin değil, kendilerine özgü antikorları (veya antijenleri) saptamak için üzerlerine adsorbe edilen yabancı antijenlerin (veya antikorların) taşıyıcılarıdır. Aglütinasyon reaksiyonu esas olarak IgG ve IgM sınıflarına ait antikorları içerir. İki aşamada ilerler: birincisi, antikorların aktif merkezinin antijen determinantı ile spesifik bir etkileşimi vardır, bu aşama elektrolitlerin yokluğunda meydana gelebilir ve reaksiyona giren sistemde gözle görülür değişiklikler eşlik etmez. İkinci aşama olan aglütinat oluşumu, antijen + antikor komplekslerinin elektrik yükünü azaltan ve bunların yapışma sürecini hızlandıran elektrolitlerin varlığını gerektirir. Bu faz aglütinat oluşumu ile sona erer.

Aglütinasyon reaksiyonları ya cam üzerine ya da pürüzsüz karton plakalara ya da steril aglütinasyon tüplerine yerleştirilir. Cam üzerinde aglütinasyon reaksiyonları (direkt ve pasif) genellikle hastanın serumundaki (örneğin brusellozda) spesifik antikorları tespit etmek veya patojenin serolojik olarak tanımlanması için hızlandırılmış bir yöntem olarak kullanılır. İkinci durumda, genellikle sadece monoreseptör antikorları veya bunların çeşitli antijenlere setlerini içeren iyi saflaştırılmış (adsorbe edilmiş) teşhis serumları kullanılır. Cam üzerindeki aglütinasyon reaksiyonunun şüphesiz avantajı, formülasyonunun basitliği ve her iki bileşen de konsantre bir biçimde kullanıldığı için birkaç dakika hatta saniye sürmesidir. Bununla birlikte, yalnızca niteliksel bir değeri vardır ve test tüpünden daha az hassastır. Test tüplerinde genişletilmiş bir aglütinasyon testi daha doğru sonuçlar verir, çünkü serumdaki antikorların kantitatif içeriğini belirlemenize (titresini ayarlamanıza) ve gerekirse, tanısal olan antikor titresindeki bir artışı kaydetmenize olanak tanır. değer. Reaksiyonu oluşturmak için %0,85 NaCl çözeltisi ile belirli bir şekilde seyreltilmiş serum ve 1 ml'de 1 milyar bakteri içeren standart bir diagnostikum (veya test kültürü) süspansiyonunun eşit hacmi (genellikle 0,5 ml) aglütinasyona verilir. tüpler. Aglütinasyon reaksiyonunun sonuçlarının muhasebeleştirilmesi, tüplerin 37 ° C sıcaklıkta 2 saat inkübasyonundan sonra ve son olarak 20-24 saat sonra iki işarete göre yapılır: çökeltinin varlığı ve boyutu ve derecesi. süpernatanın şeffaflığı. Değerlendirme dörtlü sisteme göre yapılır. Reaksiyona mutlaka serum ve antijen kontrolü eşlik eder. Patojenin serolojik tanımlaması için bir test tüpünde ayrıntılı bir aglütinasyon testinin kullanıldığı durumlarda, tanı serumu titresinin en az yarısı ile seyreltildiğinde reaksiyonun pozitif olarak değerlendirilmesi durumunda tanısal bir değeri vardır.

Homolog antijenlerin ve antikorların çözeltilerini karıştırırken, aglütinasyon reaksiyonunun görünür belirtilerinin her zaman gözlenmediği dikkate alınmalıdır. Her iki reaksiyon bileşeninin yalnızca belirli optimal oranlarında bir çökelti oluşur. Bu sınırların dışında, önemli miktarda antijen veya antikor fazlalığı ile reaksiyon gözlenmez. Bu fenomene "prozon fenomeni" denir. Hem aglütinasyon reaksiyonunda hem de çökelme reaksiyonunda gözlenir. İmmün reaksiyonlarda prozonun ortaya çıkışı, bunlara dahil olan antijenlerin kural olarak polideterminant ve moleküller olması gerçeğiyle açıklanır. IgG antikorları iki aktif merkeze sahiptir. Fazla antikor ile, her bir antijen parçacığının yüzeyi, hiçbir serbest belirleyici grup kalmayacak şekilde antikor molekülleri ile kaplanır, böylece antikorların ikinci, bağlanmamış aktif merkezi, başka bir antijenik parçacık ile etkileşime giremez ve onları birbirine bağlayamaz. Görünür bir aglütinat veya çökelti oluşumu, antikorların tek bir serbest aktif bölgesi olmadığında ve dolayısıyla antijen + antikor + antijen kompleksleri artık büyütülemediğinde, antijen fazlalığı ile de bastırılır.

1.1. AGLUTİNASYON REAKSİYONU (RA)

AGLUTİNASYON REAKSİYONU (RA)

Spesifikliği, yerleşme kolaylığı ve gösterilebilirliği nedeniyle, aglütinasyon reaksiyonu mikrobiyolojik uygulamada birçok hastalığın teşhisi için yaygın hale gelmiştir. bulaşıcı hastalıklar.

Aglütinasyon reaksiyonu, antikorların (aglütininler) tüm mikrobiyal veya diğer hücrelerle (aglutinojenler) etkileşiminin özgüllüğüne dayanır. Bu etkileşimin bir sonucu olarak, parçacıklar oluşur - pul şeklinde çökelen (aglütine olan) aglomeralar.

Hem canlı hem de ölü bakteriler, spiroketler, mantarlar, protozoa, riketsiya, ayrıca eritrositler ve diğer hücreler aglütinasyon reaksiyonuna katılabilir. Reaksiyon iki aşamada ilerler: birinci (görünmez) spesifik, antijen ve antikorların bağlanması, ikinci (görünür) spesifik olmayan, antijenlerin bağlanması, yani. aglütine oluşumu.

Aglütinat, iki değerlikli bir antikorun bir aktif merkezi, antijenin determinant grubu ile birleştirildiğinde oluşur. Aglütinasyon reaksiyonu, herhangi bir serolojik reaksiyon gibi, elektrolitlerin varlığında ilerler.

Harici olarak, pozitif bir aglütinasyon reaksiyonunun tezahürü iki yönlüdür. Yalnızca somatik bir O antijenine sahip kamçılı olmayan mikroplarda, mikrobiyal hücrelerin kendileri doğrudan birbirine yapışır. Bu tür aglütinasyona ince taneli denir. 18 22 saat içinde gerçekleşir. v

Kamçılı mikroplarda somatik O antijeni ve kamçılı H antijeni olmak üzere iki antijen bulunur. Hücreler flagella ile birbirine yapışırsa, büyük gevşek pullar oluşur ve böyle bir aglütinasyon reaksiyonuna iri taneli denir. 2 4 saatte gelir.

Aglütinasyon reaksiyonu, hem hastanın kan serumundaki spesifik antikorların niteliksel ve niceliksel olarak belirlenmesi amacıyla hem de izole edilen patojenin türünün belirlenmesi amacıyla ayarlanabilir. v

Aglütinasyon reaksiyonu, hem bir teşhis titresine seyreltilmiş serumla çalışmaya izin veren ayrıntılı bir versiyonda hem de prensip olarak spesifik antikorları tespit etmeye veya türlerini belirlemeye izin veren bir gösterge reaksiyonu kurma varyantında ayarlanabilir. patojen.

Ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu kurulurken, deneğin kan serumundaki spesifik antikorları tespit etmek için test serumu 1:50 veya 1:100 dilüsyonda alınır. Bunun nedeni, tam veya hafif seyreltilmiş serumda normal antikorların çok yüksek konsantrasyonlarda bulunabilmesi ve ardından reaksiyon sonuçlarının hatalı olabilmesidir. Reaksiyonun bu varyantındaki test materyali, hastanın kanıdır.

Kan aç karnına veya yemekten en geç 6 saat sonra alınır (aksi takdirde kan serumunda yağ damlacıkları olabilir, bu da onu bulanık ve araştırma için uygun hale getirmez). Hastanın kan serumu genellikle hastalığın ikinci haftasında elde edilir ve kübital venden 3 4 ml kan steril olarak toplanır (bu zamana kadar maksimum spesifik antikor miktarı konsantre edilir). Belirli bir antijenik yapıya sahip belirli bir türün öldürülmüş ancak yok edilmemiş mikrobiyal hücrelerinden hazırlanan bir teşhis, bilinen bir antijen olarak kullanılır.

Patojenin türünü, türünü belirlemek için ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu kurarken, antijen, test materyalinden izole edilen canlı bir patojendir. Bağışıklık teşhis serumunda bulunan antikorlar bilinmektedir. v

Bağışıklık teşhis serumu, aşılanmış bir tavşanın kanından elde edilir. Titreyi (antikorların tespit edildiği maksimum seyreltme) belirledikten sonra, teşhis serumu bir koruyucu ilavesiyle ampullere dökülür. Bu serum, izole edilen patojenin antijenik yapısı ile tanımlama için kullanılır.

AGLÜTİNASYON REAKSİYONU SEÇENEKLERİ

Parçacık şeklindeki antijenler (mikrobiyal hücreler, eritrositler ve diğer korpüsküler antijenler) bu reaksiyonlarda yer alır ve antikorlarla birbirine yapışarak çökelir.

Bir aglütinasyon reaksiyonu (RA) oluşturmak için üç bileşen gereklidir: 1) bir antijen (aglütinojen); 2) antikor (aglutinin) ve 3) elektrolit (izotonik sodyum klorür çözeltisi).

GÖSTERGE (PLAK) AGLÜTİNASYON REAKSİYONU (RA)

Yaklaşık veya katmanlı RA, oda sıcaklığında bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Bunu yapmak için, 1:10 1:20 oranında seyreltilmiş bir serum damlası ve bir kontrol damlası, bir Pasteur pipeti ile bardağa ayrı ayrı uygulanır. izotonik solüsyon sodyum klorit. Koloniler veya günlük bir bakteri kültürü (bir damla teşhis) her iki bakteriyolojik döngüye eklenir ve iyice karıştırılır. Tepkiler birkaç dakika içinde görsel olarak, bazen bir büyüteçle (x5) dikkate alınır. Serum damlasında pozitif RA ile, büyük ve küçük pulların görünümü not edilir, negatif ile serum eşit şekilde bulanık kalır.

DOLAYLI (PASİF) HEMAGLUTİNASYON REAKSİYONU (RNHA, RPHA)

Reaksiyon şu şekilde ayarlanmıştır: 1) aglütininlerle kompleksleri sıradan RA'da görülemeyen polisakkaritleri, proteinleri, bakteri özlerini ve diğer yüksek oranda dağılmış maddeleri, riketsiyaları ve virüsleri tespit etmek veya 2) hastaların serumlarında bunlara karşı antikorları tespit etmek için ayarlanır yüksek oranda dağılmış maddeler ve en küçük mikroorganizmalar.

Dolaylı veya pasif aglütinasyon altında, antikorların daha önce inert partiküller (lateks, selüloz, polistiren, baryum oksit, vb. veya ram eritrositler, I (0) insan kan grupları) üzerinde adsorbe edilmiş antijenlerle etkileşime girdiği bir reaksiyon anlaşılır.

Pasif hemaglütinasyon reaksiyonunda (RPHA), eritrositler taşıyıcı olarak kullanılır. Antijen yüklü eritrositler, bu antijene spesifik antikorların varlığında birbirine yapışır ve çökelir. Antijene duyarlı eritrositler, RPHA'da antikorların saptanması (serodiagnosis) için bir eritrosit tanılama aracı olarak kullanılır. Eritrositler antikorlarla (eritrosit antikor diagnostikum) yüklüyse, antijenleri saptamak için kullanılabilir.

sahneleme. Polistiren tabletlerin haznelerinde bir dizi seri serum seyreltisi hazırlanır. Sondan bir önceki kuyuya 0,5 ml bilinen pozitif serum eklenir ve son kuyuya 0,5 ml salin solüsyonu (kontroller) eklenir. Daha sonra tüm kuyucuklara 0,1 ml seyreltilmiş eritrosit diagnostik eklenir, çalkalanır ve 2 saat termostata konur.

Muhasebe. Olumlu bir durumda, eritrositler, deliğin dibine katlanmış veya pürüzlü kenarlı (ters bir şemsiye) düz bir hücre tabakası şeklinde yerleşirler, olumsuz bir durumda, bir düğme veya halka şeklinde yerleşirler. .

1.2. NÖTRLEŞTİRME REAKSİYONU. LİZİS,
OPSONOFAGOSİTİK REAKSİYON, AŞIRI DUYARLILIK REAKSİYONU

ANTİTOKSİN (RN) İLE EKZOTOKSİN NÖTRALİZASYON REAKSİYONU

Reaksiyon, antitoksik serumun ekzotoksin etkisini nötralize etme kabiliyetine dayanır. Antitoksik serumların titrasyonu ve ekzotoksin tayini için kullanılır.

Serum titre edildiğinde, farklı antitoksik serum dilüsyonlarına karşılık gelen toksinin belirli bir dozu eklenir. Antijenin tamamen nötralizasyonu ve kullanılmayan antikorların yokluğu ile ilk flokülasyon meydana gelir. Flokülasyon reaksiyonu sadece serum titrasyonu (örneğin difteri) için değil, aynı zamanda toksin ve toksoid titrasyonu için de kullanılabilir. Toksin nötralizasyonunun antitoksin ile reaksiyonu, antitoksik terapötik serumların aktivitesini belirleme yöntemi olarak büyük pratik öneme sahiptir. Bu reaksiyondaki antijen gerçek bir ekzotoksindir.

Antitoksik serumun gücü, geleneksel AE birimleri tarafından belirlenir.

1 AU botulinum serumu miktarı 1000 DLM botulinum toksini nötralize eder. Ekzotoksin türünü veya türünü belirlemek için nötralizasyon reaksiyonu (tetanoz, botulizm, difteri vb. Tanısında) in vitro (Ramon'a göre) ve mikrobiyal hücrelerin toksijenitesini belirlerken - jelde gerçekleştirilebilir ( Ouchterlony'ye göre).

Lizis reaksiyonu (RL)

Bağışıklık serumunun koruyucu özelliklerinden biri de vücuda giren mikropları veya hücresel elementleri çözmesidir.

Hücrelerin çözünmesine (lizisine) neden olan spesifik antikorlara lizinler denir. Antijenin doğasına bağlı olarak bakteriyolizinler, sitolizinler, spiroketolizinler, hemolizinler vb. olabilirler.

Lizinler etkilerini yalnızca ek bir faktör - tamamlayıcı varlığında gösterirler. Spesifik olmayan hümoral bağışıklığın bir faktörü olarak kompleman, beyin omurilik sıvısı ve gözün ön kamara sıvısı dışında hemen hemen tüm vücut sıvılarında bulunur. İnsan kan serumunda ve kobay kan serumunda bunun büyük bir kısmında oldukça yüksek ve sabit bir kompleman içeriği kaydedilmiştir. Diğer memelilerde kan serumundaki kompleman içeriği farklıdır.

tamamlayıcı karmaşık bir sistem peynir altı suyu proteinleri. Dengesizdir ve 55 derecede 30 dakika boyunca çöker. Oda sıcaklığında kompleman iki saat içinde yok olur. Uzun süreli çalkalamaya, asitlerin ve ultraviyole ışınların etkisine karşı çok hassastır. Bununla birlikte, tamamlayıcı, düşük bir sıcaklıkta kurutulmuş halde uzun süre (altı aya kadar) saklanır. Tamamlayıcı, mikrobiyal hücrelerin ve eritrositlerin parçalanmasını teşvik eder.

Bakteriyoliz ve hemoliz reaksiyonlarını ayırt eder.

Bakteriyoliz reaksiyonunun özü, spesifik bir bağışıklık serumu, tamamlayıcı varlığında karşılık gelen homolog canlı mikrobiyal hücrelerle birleştirildiğinde, mikropların parçalanmasıdır.

Hemoliz reaksiyonu, eritrositler, tamamlayıcı mevcudiyetinde spesifik, kendilerine karşı bağışık bir seruma (hemolitik) maruz kaldığında, eritrositlerin çözünmesi, yani. hemoliz.

Laboratuvar pratiğinde hemoliz reaksiyonu, kompleman lastiğini belirlemek ve ayrıca tanısal kompleman fiksasyon testlerinin sonuçlarını dikkate almak için kullanılır. Komplement titresi, 2,5 ml'lik bir hacimde hemolitik bir sistemde 30 dakika içinde kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına neden olan en küçük miktardır. Tüm serolojik reaksiyonlar gibi lizis reaksiyonu da bir elektrolit varlığında gerçekleşir.

AŞIRI DUYARLILIK (ALLERJİK) REAKSİYONLARI

Belirli antijen formları, vücutla tekrarlanan temas üzerine, temelde spesifik olan ancak akut bir inflamatuar yanıtın spesifik olmayan hücresel ve moleküler faktörlerini içeren bir reaksiyona neden olabilir. İki tür hiperreaktivite bilinmektedir: ani tip aşırı duyarlılık (ITH) ve gecikmeli tip aşırı duyarlılık (DTH). Birinci tip reaksiyon, antikorların katılımıyla kendini gösterirken, reaksiyon, alerjenle tekrarlanan temastan en geç 2 saat sonra gelişir. İkinci tip ise makrofajların inflamasyon bölgesinde birikmesini sağlayan reaksiyonun ana efektörleri olan inflamatuar T hücreleri (Tr3) yardımıyla gerçekleştirilir, reaksiyon 6-8 saat ve sonrasında kendini gösterir.

Bir aşırı duyarlılık reaksiyonunun gelişmesinden önce, bir antijenle karşılaşma ve duyarlılık oluşumu, yani. aktif olarak duyarlılaştırılmış lenfositler ve diğer lökositlerin (makrofajlar, granülositler) sitofilik antikorları tarafından pasif olarak duyarlılaştırılmış antikorların görünümü.

Aşırı duyarlılık reaksiyonlarının üç gelişim aşaması vardır: immünolojik; patokimyasal; patofizyolojik.

İlk spesifik fazda, alerjen, antikorlar ve/veya duyarlılaştırılmış hücreler ile etkileşime girer. İkinci aşamada, biyolojik olarak bir salınım vardır. aktif maddeler aktif hücrelerden Serbest bırakılan aracılar (histamin, serotonin, lökotrienler, bradikinin, vb.), karşılık gelen reaksiyon tipinin - üçüncü aşama - karakteristiği olan çeşitli periferik etkilere neden olur.

Dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonları

Bu tip reaksiyonlara, vücudun bağışıklık sisteminde göreceli bir yetersizlik bulunan bakteriyel antijenler tarafından bağışıklık sisteminin uzun süreli uyarılmasının neden olduğu, duyarlı hale getirilmiş Thelper'lerin, sitotoksik Tlenfositlerin (Tkillers) ve mononükleer fagosit sisteminin aktive edilmiş hücrelerinin patojenik hücreler arası etkileşimleri neden olur. bulaşıcı hastalıkların iç ortamından bakteriyel patojenleri ortadan kaldırmak için sistem. Bu aşırı duyarlılık reaksiyonları, tüberkülozlu hastalarda tüberküloz akciğer boşluklarına, kazeöz nekrozlarına ve genel zehirlenmeye neden olur. Morfopatogenetik açıdan tüberküloz ve cüzzamdaki deri granülomatozu, büyük ölçüde dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarından oluşur.

Tip 4 aşırı duyarlılık reaksiyonunun en ünlü örneği, vücudu ve sistemi mikobakteriyel antijenlere duyarlı hale gelmiş bir hastaya intradermal tüberkülin uygulama bölgesinde gelişen Mantoux reaksiyonudur. Reaksiyonun bir sonucu olarak, tüberkülinin intradermal uygulamasından sadece birkaç saat sonra (yavaşça) ortaya çıkan, merkezinde nekrozu olan yoğun bir hiperemik papül oluşur. Bir papül oluşumu, vasküler yataktan dolaşımdaki kanın mononükleer fagositlerinin hücreler arası boşluklarına çıkmasıyla başlar. Eşzamanlı olarak, polimorfonükleer hücrelerin damar yatağından göçü başlar. Daha sonra nötrofil infiltrasyonu azalır ve infiltrat ağırlıklı olarak lenfositler ve mononükleer fagositlerden oluşmaya başlar. Bu, lezyon bölgesinde ağırlıklı olarak polimorfonükleer lökositlerin biriktiği Mantoux reaksiyonu ile Arthus reaksiyonu arasındaki farktır.

Dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarında, duyarlılaştırılmış lenfositlerin antijenlerle uzun süreli uyarılması, dokularda patolojik değişikliklerin olduğu yerlerde T-yardımcıları tarafından patolojik olarak yoğun ve uzun süreli sitokin salınımına yol açar. Doku hasarı lokuslarında yoğun bir sitokin salınımı, orada bulunan mononükleer fagositler sisteminin hücrelerinin hiperaktivasyonuna neden olur; bunların çoğu hiperaktif durumda epiteloid hücre şeritleri oluşturur ve bazıları dev hücreler oluşturmak için birbirleriyle birleşir. Yüzeyinde bakteriyel ve viral antijenlerin açığa çıktığı makrofajlar, Tkiller'lerin (doğal öldürücüler) işleyişiyle yok edilebilir.

Dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonu, yabancı bir bakteriyel antijenin ona karşı duyarlı hale gelen T-yardımcıları tarafından tanınmasıyla indüklenir. Tanıma için gerekli bir koşul, indükleyicilerin endositozdan sonra antijen sunan hücrelerin yüzeyinde açığa çıkan antijenlerle etkileşimi ve yabancı immünojenlerin mononükleer fagositler tarafından işlenmesidir. Bir diğer gerekli kondisyon ana doku uyumluluk kompleksinden sınıf I moleküllerle kombinasyon halinde antijenlerin maruz kalması. Antijen tanınmasından sonra, duyarlı hale getirilmiş yardımcılar, sitokinleri ve özellikle doğal öldürücüleri ve mononükleer fagositleri aktive eden interlökin2'yi serbest bırakır. Aktif mononükleer fagositler, dokulara zarar veren proteolitik enzimler ve serbest oksijen radikallerini serbest bırakır.

Skinallerjik testler vücudun alerjenlere karşı duyarlılığını belirlemek, örneğin tüberküloz, bruselloz gibi enfeksiyonunu, örneğin tularemiye karşı sürü bağışıklığı seviyesini belirlemek için yapılan testler. Alerjenin giriş yerine göre: 1) cilt testleri; 2) kazıma; 3) intradermal; 4) deri altı. Deri alerjik testinde bir alerjene klinik reaksiyon, lokal, genel ve fokal, ayrıca ani ve gecikmeli olarak ayrılır.

Aracı tip HIT'in lokal reaksiyonları 5-20 dakika sonra ortaya çıkar, eritem ve kabarcık olarak ifade edilir, birkaç saat sonra kaybolur, artı yöntemiyle eritem miktarı mm olarak ölçülür. HRT'nin lokal reaksiyonları 24-48 saat sonra ortaya çıkar, uzun sürer, bir infiltrat olarak, bazen merkezde nekrozla birlikte ortaya çıkar ve infiltratın mm cinsinden boyutu ve yine artı sistem tarafından değerlendirilir. GNT'nin sitotoksik ve immünkompleks tiplerinde hiperemi ve infiltrasyon 3-4 saat sonra gözlenir, 6-8 saatte maksimuma ulaşır ve yaklaşık bir gün sonra azalır. Bazen kombine reaksiyonlar gözlenir.

1.3. TAMAMLAYICI BAĞLAMA REAKSİYONU (CFR)

Bu reaksiyon için kullanılır laboratuvar araştırmasıçeşitli enfeksiyonlarda kan serumundaki antikorların tespiti ve ayrıca antijenik yapı ile patojenin tanımlanması için.

Kompleman fiksasyon testi, karmaşık bir serolojik testtir ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile karakterize edilir.

Bu reaksiyonun bir özelliği, spesifik antikorlarla etkileşimi sırasında antijendeki değişikliğin yalnızca kompleman varlığında meydana gelmesidir. Tamamlayıcı, yalnızca antikor-antijen kompleksi üzerinde adsorbe edilir. Bir antikor-antijen kompleksi, yalnızca antijen ile serumda bulunan antikor arasında bir afinite varsa oluşur.

"Antijen antikor" kompleksi üzerindeki kompleman adsorpsiyonu, özelliklerine bağlı olarak antijenin kaderini farklı şekillerde etkileyebilir.

Bazı antijenler, bu koşullar altında çözünmeye kadar (hemoliz, Isaev-Pfeifer fenomeni, sitolitik etki) keskin morfolojik değişikliklere uğrar. Diğerleri hareket hızını değiştirir (treponema hareketsizleştirme). Yine de diğerleri keskin olmadan ölür yıkıcı değişiklikler(bakterisidal veya sitotoksik etki). Son olarak, kompleman adsorpsiyonuna, antijende kolayca gözlemlenebilen değişiklikler eşlik etmeyebilir.

Mekanizmaya göre, RSC iki aşamada ilerler:

1. Birinci aşama, “antijen antikor” kompleksinin oluşumu ve bu kompleman kompleksi üzerine adsorpsiyondur. Fazın sonucu görsel olarak görünmez (komplementin zorunlu katılımı ile antijen ve antikorların etkileşimi).
2. İkinci aşama, kompleman varlığında spesifik antikorların etkisi altında antijende bir değişikliktir. Fazın sonucu görsel olarak görülebilir veya görülmeyebilir (reaksiyon sonuçlarının bir gösterge hemolitik sistem (koyun eritrositleri ve hemolitik serum) kullanılarak saptanması).

Eritrositlerin hemolitik serum tarafından yok edilmesi, yalnızca hemolitik sisteme kompleman bağlanması durumunda meydana gelir. Tamamlayıcı, antijen-antikor kompleksi üzerinde daha önce adsorbe edilmişse, eritrositlerin hemolizi gerçekleşmez.

Deneyin sonucu, tüm test tüplerinde hemoliz olup olmadığına dikkat edilerek değerlendirilir. Reaksiyon, test tüpündeki sıvı renksiz olduğunda ve eritrositler dibe çöktüğünde, hemolizde tam bir gecikme ile pozitif olarak kabul edilir, sıvı yoğun bir şekilde renkli olduğunda ("lak" kan) eritrositlerin tamamen parçalanması ile negatif olarak kabul edilir. Hemoliz gecikme derecesi, sıvının renk yoğunluğuna ve dipteki eritrosit sediment miktarına (++++, +++, ++, +) bağlı olarak tahmin edilir.

Antijendeki değişikliklerin görsel gözlem için erişilemez durumda kalması durumunda, tamamlayıcının durumunu değerlendirmenize ve reaksiyonun sonucu hakkında bir sonuç çıkarmanıza izin veren bir gösterge görevi gören ikinci bir sistem kullanmak gerekir.

Bu gösterge sistemi, koyun eritrositlerini ve eritrositlere spesifik antikorlar (hemolizinler) içeren, ancak tamamlayıcı içermeyen hemolitik serumu içeren hemoliz reaksiyonunun bileşenleri ile temsil edilir. Bu gösterge sistemi, ana CSC ayarlandıktan bir saat sonra test tüplerine eklenir. Kompleman fiksasyon reaksiyonu pozitif ise, komplemanı kendi üzerine adsorbe eden bir antikor-antijen kompleksi oluşur. Kompleman sadece bir reaksiyon için gerekli miktarda kullanıldığından ve eritrosit lizisi sadece kompleman varlığında gerçekleşebildiğinden, “antijen antikor” kompleksi üzerine adsorbe edildiğinde hemolitik (gösterge) sistemde eritrosit lizisi oluşmayacaktır. . Kompleman fiksasyon reaksiyonu negatif ise “antijen antikor” kompleksi oluşmaz, kompleman serbest kalır ve hemolitik sistem eklendiğinde eritrosit lizisi meydana gelir.

1.4. DNASONDALARI. POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR),
ENZİM BAĞIŞIKLIK YÖNTEMİ (ELISA), FLORESAN ANTİKOR YÖNTEMİ (MFA)

GEN ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ

Moleküler biyolojinin yoğun gelişimi ve genetik araştırma için mükemmel bir metodolojik temelin oluşturulması, genetik mühendisliğinin temeli haline geldi. Teşhis alanında, DNA ve RNA'nın spesifik nükleotit dizilerini belirlemek için gen araştırması olarak adlandırılan bir yön ortaya çıktı ve hızla gelişiyor. Bu tür yöntemler, tamamlayıcı nükleotitlerin (AT, GC) etkileşimi nedeniyle nükleik asitlerin çift sarmallı yapılar oluşturmak üzere hibritleşme yeteneğine dayanır.

İstenen DNA (veya RNA) dizisini belirlemek için, özel olarak belirli bir baz dizisine sahip bir polinükleotit probu oluşturulur. Bileşimine, kompleksin oluşumunu tanımlamayı mümkün kılan özel bir etiket eklenmiştir.

Gen araştırması, immünokimyasal analiz yöntemlerine atfedilemezse de, ana ilkesi (tamamlayıcı yapıların etkileşimi), immünodiagnostik gösterge yöntemleriyle aynı yöntemlerle metodik olarak uygulanır. Ek olarak, gen araştırma yöntemleri, fenotipik ifadesinin yokluğunda (genomda yerleşik virüsler, "sessiz" genler) enfeksiyöz bir ajan hakkındaki bilgilerin doldurulmasını mümkün kılar.

DNA analizi için numune, DNA veya RNAprob moleküllerinin reaksiyona girdiği tek sarmallı yapılar elde etmek için denatürasyona tabi tutulur. Probların hazırlanması için, genellikle vektör plazmitlerinin bir parçası olarak genetik diziler olarak sunulan, doğal bir kaynaktan (örneğin, bir veya başka bir mikroorganizma) izole edilen çeşitli DNA (veya RNA) bölümleri veya kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotitler kullanılır. Bazı durumlarda, fragmanlar halinde hidrolize edilmiş genomik DNA preparasyonları, bazen RNA preparasyonları, özellikle sıklıkla ribozomal RNA bir prob olarak kullanılır. Aynı göstergeler etiket olarak kullanılır. çeşitli tipler immünokimyasal analiz: radyoaktif izotoplar, floreseinler, biyotop (avidinenzim kompleksi tarafından daha fazla tezahür ile), vb.

Analizin sırası, mevcut probun özelliklerine göre belirlenir.

Şu anda, gerekli tüm bileşenleri içeren ticari kitler giderek daha fazla kullanılmaktadır.

Çoğu durumda, analiz prosedürü aşağıdaki aşamalara ayrılabilir: numune hazırlama (DNA ekstraksiyonu ve denatürasyonu dahil), numunenin bir taşıyıcı üzerinde sabitlenmesi (çoğunlukla bir polimer membran filtre), ön hibridizasyon, hibridizasyonun kendisi, bağlanmamış ürünlerin yıkanması, tespit etme. Standart bir DNA veya RNAprobu preparasyonu olmadığında, önce elde edilir ve etiketlenir.

Numune hazırlama için, tek tek bakteri kolonilerini tanımlamak veya hücre kültüründeki virüs konsantrasyonunu artırmak için test materyalini "büyütmek" gerekebilir. Enfeksiyöz bir ajanın varlığı için kan serumu, idrar, kan hücreleri veya tam kan numunelerinin doğrudan analizi de gerçekleştirilir. Bileşimden nükleik asitleri serbest bırakmak için hücre yapıları hücre parçalanması gerçekleştirilir ve bazı durumlarda DNA preparasyonu fenol ile saflaştırılır.

DNA'nın denatürasyonu, yani tek sarmallı bir forma geçişi, alkali ile muamele sırasında meydana gelir. Nükleik asit numunesi daha sonra, genellikle 80°C'de vakum altında 10 dakika ila 4 saat süreyle inkübasyon yoluyla bir nitroselüloz veya naylon membran taşıyıcı üzerine sabitlenir. Ayrıca, ön hibridizasyon sürecinde, probun zar ile spesifik olmayan etkileşimini azaltmak için serbest bağlanma bölgelerinin etkisizleştirilmesi sağlanır. Hibridizasyon işlemi, numunedeki DNA konsantrasyonuna, kullanılan probun konsantrasyonuna ve boyutuna bağlı olarak 2 ila 20 saat sürer.

Hibridizasyon tamamlandıktan ve bağlanmamış ürünler yıkandıktan sonra ortaya çıkan kompleks saptanır. Prob bir radyoaktif etiket içeriyorsa, membran, reaksiyonu (otoradyografi) göstermek için fotoğraf filmine maruz bırakılır. Diğer etiketler için uygun prosedürleri kullanın.

En umut verici olanı, radyoaktif olmayan (soğuk denilen) probların üretilmesidir. Aynı temelde, özellikle patomorfolojik analizde (in situ hibridizasyon) önemli olan bölümlerin hazırlanmasında, doku delinmelerinde bir patojenin varlığının tespit edilmesini mümkün kılan bir hibridizasyon tekniği geliştirilmektedir.

Gen araştırma yöntemlerinin geliştirilmesinde önemli bir adım, polimeraz amplifikasyon reaksiyonunun (PCR) kullanılmasıydı. Bu yaklaşım, bir numunedeki belirli (önceden bilinen) bir DNA dizisinin konsantrasyonunu, birden çok kopyayı in vitro sentezleyerek artırmayı mümkün kılar. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, bir DNA polimeraz enzim preparasyonu, sentez için fazla miktarda deoksinükleotit ve sözde primerler, ilgili DNA dizisinin terminal bölümlerine karşılık gelen 20-25 bazlı iki tip oligonükleotit eklenir. İncelenen DNA örneği. Primerlerden biri, 53 okuma yönünde kodlayan DNA sarmalının okuma bölgesinin başlangıcının bir kopyası, ikincisi ise kodlamayan sarmalın karşı ucunun bir kopyası olmalıdır. Daha sonra, polimeraz reaksiyonunun her döngüsünde, DNA kopyalarının sayısı iki katına çıkar.

Primerlerin bağlanması için 94°C'de DNA denatürasyonu (erime) ve ardından karışımın 4055°C'ye getirilmesi gerekir.

Reaksiyonu gerçekleştirmek için programlanabilir mikro numune inkübatörleri, reaksiyonun her aşaması için optimum olan sıcaklık değişikliklerini kolayca değiştirecek şekilde tasarlandı.

Amplifikasyon reaksiyonu, enfeksiyöz ajanın düşük konsantrasyonlarında özellikle önemli olan gen araştırması sırasında analizin hassasiyetini önemli ölçüde artırabilir.

Amplifikasyonlu gen araştırmasının önemli avantajlarından biri, mikroskobik bir miktardaki patolojik materyali inceleme olasılığıdır.

Yöntemin enfeksiyöz materyalin analizi için daha önemli olan bir diğer özelliği de gizli (sessiz) genleri tespit edebilmesidir. Gen araştırmasının kullanımına ilişkin yöntemler, daha basit ve daha ucuz hale geldikçe, bulaşıcı hastalıkların teşhisi pratiğine kesinlikle daha yaygın bir şekilde dahil edilecektir.

ELISA ve RIF yöntemleri çoğunlukla niteliksel veya yarı nicelikseldir. Bileşenlerin çok düşük konsantrasyonlarında, bir antijen-antikor kompleksinin oluşumu görsel olarak veya basit araçsal yollarla kaydedilemez. Bu gibi durumlarda antijen antikor kompleksinin belirtilmesi, antijen veya antikorun başlangıç ​​bileşenlerinden birinin, belirlenecek analitin konsantrasyonuyla karşılaştırılabilir konsantrasyonlarda kolaylıkla saptanabilen bir etiket ortaya koyması halinde gerçekleştirilebilir.

Etiket olarak radyoaktif izotoplar (örneğin 125I), floresan maddeler ve enzimler kullanılabilir.

Kullanılan etikete bağlı olarak, radyoimmün (RIA), floresan immün (FIA), enzim immünoassay (ELISA) analiz yöntemleri vb. son yıllar geniş pratik kullanım nicel tespitler, yüksek hassasiyet, özgüllük ve muhasebe otomasyonu olasılığı ile ilişkili bir ELISA aldı.

ELISA analiz yöntemleri, renkli bir görünümle bir enzim tarafından bölünen bir substrat kullanılarak bir antijen antikor kompleksinin saptanmasına izin veren bir grup yöntem.

Metodun özü, antijen antikor reaksiyonunun bileşenlerinin ölçülen bir enzim etiketi ile kombinasyonunda yatmaktadır. Reaksiyona giren antijen veya antikor, bir enzimle etiketlenir. Enzimin etkisi altında substratın dönüştürülmesiyle, etkileşime giren antijen-antikor reaksiyonu bileşeninin miktarı yargılanabilir. Bu durumda enzim, bağışıklık tepkisinin bir belirteci olarak hizmet eder ve onu görsel veya araçsal olarak gözlemlemenizi sağlar.

Bir enzim molekülü dakikada 1 x 105'ten fazla katalitik ürün molekülü üretebildiğinden, enzimler çok uygun etiketlerdir çünkü katalitik özellikleri onların güçlendirici olarak hareket etmelerine izin verir. Katalitik aktivitesini uzun süre koruyan, bir antijen veya antikora bağlandığında kaybetmeyen ve substrata göre özgüllüğü yüksek bir enzim seçmek gerekir.

Bir enzimle işaretlenmiş antikorları veya antijenleri elde etmenin ana yöntemleri, konjugatlar: kimyasal, immünolojik ve genetik mühendislik. Enzimler genellikle ELISA için kullanılır: yaban turpu peroksidaz, alkalin fosfataz, galaktosidaz, vb.

Reaksiyonun görsel ve araçsal kaydı amacıyla antijen-antikor kompleksindeki enzimin aktivitesini tespit etmek için, çözeltileri başlangıçta renksiz olan, yoğunluğu enzimatik reaksiyon sırasında bir renk kazanan kromojenik substratlar kullanılır. enzim miktarı ile orantılıdır. Bu nedenle, katı faz ELISA'da yaban turpu peroksidaz aktivitesini saptamak için, substrat olarak yoğun bir kahverengi renk veren 5 aminosalisilik asit, turuncu-sarı bir renk oluşturan ortofenilendiamin kullanılır. Alkali fosfataz ve agalatosidaz aktivitesini saptamak için sırasıyla nitrofenilfosfatlar ve nitrofenilgalaktozitler kullanılır.

Renkli bir ürünün oluşumundaki reaksiyon sonucu, görsel olarak veya belirli bir dalga boyuna sahip ışığın soğurulmasını ölçen bir spektrofotometre kullanılarak belirlenir.

ELISA'yı evrelemek için birçok seçenek vardır. Homojen ve heterojen çeşitleri vardır.

Kurulum yöntemine göre, rekabetçi ve rekabetçi olmayan ELISA yöntemleri ayırt edilir. İlk aşamada sistemde yalnızca analiz edilen bileşik ve buna karşılık gelen bağlanma merkezleri (antijen ve spesifik antikorlar) mevcutsa, bu durumda yöntem rekabetçi değildir. Analiz edilen bileşik (antijen) ve onun analoğu (enzim etiketli antijen) birinci aşamada mevcutsa ve eksiklikte bulunan spesifik bağlanma merkezlerine (antikorlar) bağlanmak için birbirleriyle rekabet halindeyse, o zaman yöntem rekabetçidir. Bu durumda, test antijeni çözeltiyi ne kadar çok içerirse, bağlı işaretli antijenlerin miktarı o kadar az olur.

FLORESAN ANTİKOR YÖNTEMİ (MFA) veya İMMÜNOFLORESAN REAKSİYONLARI (RIF)

İmmünofloresan yöntemi, test materyalinde bilinmeyen bir mikroorganizmanın hızlı tespiti ve tanımlanması için tercih edilen yöntemdir.

Ag + AT + elektrolit = UV ışık kompleksi

Florokrom ile etiketlenmiş mikrop serumu

Floresein izotiyosiyanat boyası genellikle FITC olarak kullanılır

Bu çalışmada floresan mikroskop kullanılmıştır.

RIF aşaması

Smere 30 µl FITC etiketli antikor solüsyonu uygulanır.

Camı nemli bir odaya yerleştirin ve oda sıcaklığında 20-25 dakika veya termostatta 37°C'de 15 dakika inkübe edin.

Bardağı akan musluk suyunda 2 dakika çalkalayın, distile su ile durulayın ve havada kurutun.

Kurutulmuş yaymaya bir damla montaj sıvısı uygulanır, yayma bir lamel ile kaplanır ve bir flüoresan mikroskobu veya geleneksel bir optik mikroskoba bir flüoresan eki kullanılarak mikroskoplanır.

Aglütinasyon reaksiyonu.

Bir aglütinasyon reaksiyonu, bir elektrolit varlığında antikorların etkisi altında mikrobiyal veya diğer hücrelerin (eritrositler) yapışması ve çökelmesidir. Reaksiyonun görünür etkisi (aglütinasyon fenomeni), aglütinat olarak adlandırılan bir çökeltinin oluşmasıdır.

Bu reaksiyon için kullanılır serolojik teşhis Ve seri tanımlama. RA, serodiagnoz (hastaların kan serumundaki antikorların saptanması) amacıyla kullanılır. Tifo ve paratifoid(Vidal reaksiyon), bruselloz(Wright tepkisi), tularemi ve leptospirosis. RA seroidifikasyon (hastadan izole edilen patojen tipinin belirlenmesi) için kullanılır. bağırsak enfeksiyonları boğmaca, kolera ve benzeri.

Bileşenlerreaksiyonlar:

1 A antijen (aglütinojen) - bunlar bütün (yok edilmemiş) mikrobiyal veya diğer hücrelerdir ( tanecikli, çözünmez antijen). aglütinojenler- bu bir askıya alma canlı veya öldürdü mikrobiyal hücreler veya diğer hücreler. Antijenler bilinmeyen veya bilinen olabilir. Bilinmeyen bir aglütinojen, belirlenmesi gereken bir hastanın vücudundan izole edilen bir mikrobiyal kültürdür. bilinen antijen teşhis- teşhis ilacı - ölülerin askıya alınması mikroplar bilinen türler fizyolojik solüsyonda Bu süspansiyon puslu (opak)), Çünkü mikrobiyal hücreler çözülmez, bozulmadan kalır. Hastanın serumundaki bilinmeyen antikorları saptamak için bilinen bir aglütinojen kullanılacaktır.

2. Antikor (aglütinin)- kan serumunda bulunur. Antikorlar ayrıca bilinmeyen veya bilinen olabilir. Kan serumunda belirlenemeyen antikorların bulunması Hasta kişi. Bilinen antikorlar bulunur bağışıklık teşhis serumu, denilen aglutinasyon serumu. Serotanımlama için kullanılırlar, örn. bilinmeyen bir antijeni belirlemek için - bir tür mikrobiyal kültür.

3. Elektrolit- %0,9 sodyum klorür çözeltisi.

RA ayarlama yolları.

1. Yaklaşık (plaka) RA- cam üzerinde gerçekleştirilir. Bir cam slayta 2 damla serum ve 1 damla izotonik solüsyon uygulayın. Serum damlalarından birine ve bir damla izotonik solüsyona bir öze ile mikrobiyal kültür verilir ve karıştırılır. Damla izotonik solüsyon mikroplarla – antijen kontrolü, Bir damla mikropsuz serumlar – antikor kontrolü, Bir damla mikroplu serum – deneyim. Serum, kendisiyle karıştırılan mikrobiyal antijenlere karşılık gelen antikorlar içeriyorsa, antikorlar ve antijenler spesifik olarak birbirine bağlanacak ve 1-3 dakika sonra deney damlasında aglütinet pullar görünecektir. Antijen kontrolü bulanık ve antikor kontrolü açık olmalıdır. Reaksiyonun sonuçlarının muhasebeleştirilmesi, aglütinat pullarının ortaya çıkmasıyla gerçekleştirilir. . Pullar düşerse, reaksiyon pozitiftir, yani. bir antijen, bir antikora karşılık gelir ve bir antijen, bir antikoru tanımlamak için kullanılabilir veya bunun tersi de geçerlidir. Bulanıklık kalırsa, reaksiyon negatiftir.

2. Genişletilmiş aglütinasyon reaksiyonu - test tüplerinde gerçekleştirilmiştir. Önce hasta bir kişinin kan serumundan 1:50 ila 1:1600 oranında 2 kat dilüsyon hazırlanır. 6 test tüpüne 1 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi dökülür. Birinci test tüpüne 1:50 dilüsyondaki 1 ml hasta kan serumu eklenir, karıştırılır ve 1:100 dilüsyon elde edilir, ardından ikinci test tüpüne 1:100 dilüsyonlu 1 ml hasta kanı aktarılır. ve 1:200'lük bir seyreltme elde edilir, vb. Antijen ve serumu kontrol etmek için iki test tüpü bırakılır. Serum kontrolüne sadece 1:50 seyreltilmiş serum eklenir, antijen kontrolüne sadece antijen eklenir. Diğer tüm tüplere 0,1 ml antijen -diagnostikum (O- veya H-) eklenir ve tüm tüpler 37°C'de 18-20 saat termostata yerleştirilir. Reaksiyon sonuçlarının muhasebesi, oluşan çökeltinin (aglütinat) doğasına, miktarına ve bulanıklık derecesine göre yapılır. Hesaplama, kontrollerde yalnızca aşağıdaki sonuçlarla gerçekleştirilir: serum kontrolü - şeffaf, antijen kontrolü - bulutlu. O-antikorları ince taneli bir çökelti verir. H-antikorları - iri taneli. Aglütinasyon reaksiyonunun hala görülebildiği son test tüpüne göre, set teşhis titresi.

Hastalıklara serodiagnostik yapılırken, sadece belirli bir patojene karşı spesifik antikorları saptamak değil, aynı zamanda bunların sayısını, yani; Bu patojenin neden olduğu bir hastalığın varlığından bahsedebildiğimizde böyle bir antikor titresi kurmak. Bu titre tanısal titre olarak adlandırılır. Örneğin, tifo ateşini teşhis etmek için, 1:400'lük bir antikor titresinin saptanması gerekir, ancak daha az olamaz. Hatta eşli serumlarda antikor artışı saptanarak daha doğru sonuçlar elde edilir.Hastalığın başlangıcında ve 3-5 gün veya daha sonra hastanın serumu alınır. Antikor titresi en az 4 kat artarsa ​​o zaman mevcut hastalıktan bahsedebiliriz.

Hedef: Bulaşıcı hastalıkların teşhisi için aglütinasyon reaksiyonunu ve çökelme reaksiyonunu evreleme tekniğinde ustalaşmak.

Modül 1 Mikroorganizmaların morfolojisi ve fizyolojisi. enfeksiyon. Bağışıklık.

Konu 16: Aglütinasyon reaksiyonu. Yağış reaksiyonu.

Konunun alaka düzeyi. Altında dokunulmazlık vücudun bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan maddelere (patojenik mikroorganizmalar, yabancı proteinler ve diğer maddeler) karşı bağışıklığını ifade eder. Bu ajanlara antijen denir. Bağışıklık ya doğuştandır ya da edinilmiştir. Doğuştan- Doku ve hümoral koruyucu cihazlar oluştuğunda, kalıtsal olan bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklığa neden olur.

Edinilen- vücudun bağışıklık sistemi tarafından antikor üretimi veya duyarlı lenfositlerin birikmesi şeklinde gerçekleştirilir. Alt bölümlere ayrılmıştır doğal ve yapay. Etki mekanizmasına göre, ikiye ayrılır: aktif ve pasif. Tüm immünolojik reaksiyonlarda ana bileşen antijendir.

ana işlev bağışıklık sistemi lenfoid dokudan oluşan yabancı ajanların (antijenlerin) tanınması ve nötralize edilmesidir.

Antijenler vücuda şu yollarla girebilir: hava yolları, sindirim sistemi, deri ve mukoza zarları yoluyla. Her antijen, spesifik protein maddelerinin - antikorların oluşumunu uyarır.

antijenler tam ve aşağı (haptens) olarak bölünmüştür. Komple antijenler tam bir bağışıklık tepkisi oluşturur. kusurlu antijenler bağımsız olarak bir bağışıklık tepkisine neden olmazlar, ancak bazen bu yeteneği yüksek moleküler ağırlıklı protein taşıyıcılarla konjuge edildiğinde kazanırlar. Ayrıca antijenler de vardır: yarı haptenler, proantijenler, heteroantijenler ve izoantijenler.

antikorlar insan veya hayvan serumu immünoglobülinleridir. Antikorlar, bir enfeksiyondan sonra ve zayıflatılmış veya öldürülmüş bakteriler, riketsiyalar, virüsler, toksinler ve diğer maddelerle bağışıklamanın bir sonucu olarak oluşur. antikorlar- immünoglobulin proteinleri kimyasal bileşim glikoproteinlere aittir. Yapılarına ve immünobiyolojik özelliklerine göre, immünoglobulinler ayrılır: 5 sınıf: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

normal antikorlar aşılanmamış insan ve hayvanlarda bulunur. Spesifik antikorlar enfeksiyon veya bağışıklama sonucu oluşur.

Bir antikor ile bir antijen arasındaki reaksiyona denir. serolojik. Serolojik reaksiyonlar oldukça spesifiktir ve birçok bulaşıcı hastalığın teşhisinde kullanılır. Aglütinasyon ve çökelme reaksiyonları vardır.

1. Aglütinasyon reaksiyonu (RA) bir elektrolit varlığında mikrobiyal cisimlerin aglütinasyonu ve çökelmesinin meydana geldiği bir antijen (aglütinojen) ve bir antikorun (aglütinin) etkileşimine dayanır. Aglütinasyon reaksiyonunun formülasyonunun çeşitli modifikasyonları vardır.

En yüksek değer sahip olmak:

- Test tüplerinde makroskopik (dağıtılmış) aglütinasyon. Hastanın serumuna bir mikrop süspansiyonu (diagnosticum) eklenir ve 37 derecelik bir termostatta 1 saat sonra reaksiyonun meydana geldiği serumun seyreltilmesi (titresi) not edilir. Bir aglütinasyon reaksiyonu, tüpün dibinde süpernatanda belirgin bir berraklaşma ile bir çökelti oluştuğunda pozitif olarak kabul edilir. Bu çökeltiye aglütinat denir.

Aglütinatın doğasına göre ince taneli (O) ve iri taneli (H) aglütinasyon ayırt edilir. İnce taneli aglütinatı tespit etmek için bir aglütinoskop kullanılır. Sonuçların muhasebesi kontrol tüpleriyle başlar. Aglütinasyonun gözlendiği serumun son dilüsyonu titre olarak kabul edilir.

Reaksiyonun amacı: hastanın serumunda antikorların saptanması.

- mikroskobik (hızlandırılmış) ) cam üzerinde yaklaşık aglütinasyon. Bir damla tanısal immün seruma bir damla bakteri kültürü eklenir ve eşit şekilde karıştırılır. Reaksiyon oda sıcaklığında 5-10 dakika sonra devam eder. Sonra bir hesap yapılır. Bir damla serumda pozitif bir reaksiyonla, tanecikler veya pullar şeklinde bakteri birikimi görülür. Reaksiyonun amacı: bilinen bir teşhis serumuna göre patojen tipini belirlemek.

- Dolaylı (pasif) hemaglütinasyonun (RNGA) reaksiyonu. Bu reaksiyonun özü, koç eritrositlerinin antijenleri yüzeylerine adsorbe edebilmelerinde yatmaktadır. Spesifik antikorların etkisi altında, eritrositler birbirine yapışır ve çökelerek altta hemaglutinat oluşturur. Reaksiyon oldukça hassas ve spesifiktir. RNGA tespit etmenizi sağlar minimum miktar antikorlar ve kusurlu polisakarit antijenleri. Bu reaksiyon birçok bulaşıcı hastalığın (abdominal ve tifüs, paratifoid, tüberküloz vb.).

2. Yağış reaksiyonu (RP ) – antijen-antikor kompleksinin çökelmesi. RP ve RA arasındaki temel fark, RA'da bir korpüsküler antijen kullanılırken, RP'de bir antijen, protein veya polisakkarit yapısındaki koloidal bir maddedir. Bu reaksiyonda antijene presipitinojen, antikorlara presipitin adı verilir. Reaksiyon, antijen solüsyonunu immün serum üzerine katmanlayarak test tüplerine konur. Sınırda antijen ve antikorların optimum oranı ile

bu çözeltiler bir çökelti halkası oluşturur. Antijen olarak organ ve dokuların kaynatılıp süzülmüş ekstraktları kullanılırsa reaksiyona termopresipitasyon reaksiyonu (Tanı koymada konulan Ascoli reaksiyonu) denir. şarbon, veba, tularemi vb.).

geniş kullanım agarda elde edilen çökelme reaksiyonları: basit difüzyon yöntemi, çift difüzyon yöntemi.

Bir yağış türü flokülasyon reaksiyonu- toksoid veya antitoksik serumun aktivitesini belirlemek için. Ek olarak, bu reaksiyon Corynebacterium diphtheriae suşlarının toksijenitesini belirlemek için kullanılabilir.

Özel hedefler:

· Bağışıklık yanıtının indükleyicileri olarak antijenlerin rolünü açıklamak;

· Mikroorganizmaların antijenleri de dahil olmak üzere antijenlerin yapısını tanımlayın;

· Aglütinasyon reaksiyonunun mekanizmasını tanımlayın;

· Çökelme reaksiyonunun mekanizmasını açıklayınız.

Yapabilmek:

· Bağışıklık yanıtının indükleyicileri olarak antijenlerin rolünü açıklamak;

Antikorların yapısını tanımlayın (farklı immünoglobulin sınıfları);

· Antikorların antijenlerle etkileşim mekanizmasını analiz etmek;

· Aglütinasyon reaksiyonunun sonuçlarını yorumlamak;

· Çökeltme reaksiyonunun sonuçlarını yorumlar;

· Sonuçları analiz edin.

Teorik sorular:

1. "Antijenler", "antikorlar" kavramının tanımı.

2. Antijenlerin bağışıklık yanıtının indükleyicileri olarak rolü.

3. Antikorların yapısı (farklı immünoglobulin sınıfları).

4. Antikorların antijenlerle etkileşim mekanizması.

5. Bağışıklık sisteminin reaksiyonları, bağışıklık tepkisindeki rolü ve bulaşıcı hastalıkların teşhisi.

6. Aglütinasyon reaksiyonunun mekanizması.

7. Çökeltme reaksiyonunun mekanizması.

Sınıfta gerçekleştirilen pratik görevler:

1. Hastanın serumundaki antikorları saptamak için bir aglütinasyon reaksiyonu kurmak.

2. Saf bir bakteri kültürünü tanımlamak için teşhis serumu ile cam üzerinde bir mikroaglütinasyon reaksiyonu kurmak.

3. Aglütinasyon reaksiyonunun sonuçlarının değerlendirilmesi.

4. Bakteriyel antijeni saptamak için bir çökeltme reaksiyonunun ayarlanması.

5. Çökeltme reaksiyonunun sonuçlarının değerlendirilmesi.

6. Dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonunun sonuçlarının değerlendirilmesi.

7. Protokolün kaydı.

Edebiyat:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Viroloji ve immünoloji ile Mikrobiyoloji.- Kiev: Higher School, 1992.- 431p.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiyoloji.- M.: Tıp, 1998.- 336s.

3. Tıbbi mikrobiyoloji / Düzenleyen V.P. Pokrovsky.- M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Tıbbi mikrobiyoloji, immünoloji ve viroloji / Tıp üniversiteleri için ders kitabı, St. Petersburg: "Özel Literatür", 1998.- 592s.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiyoloji / Ders Kitabı - 2. baskı, Gözden geçirilmiş. ve ekleyin - M .: Tıp, 1983.- 512s.

6. Ders notları.

Ek literatür:

1. Titov M.V. bulaşıcı hastalıklar.- K., 1995.- 321s.

2. Shuvalova E.P. Bulaşıcı hastalıklar - M .: Tıp, 1990. - 559s.

Kan aglütinasyonu, kırmızı kan hücrelerinin, bakterilerin ve antijen taşıyan diğer hücrelerin aglütinasyonu ve sedimantasyonudur.

İşlem, spesifik maddeler olan aglütininlerin etkisi altında gerçekleşir. Bu maddelerin rolü lektinler veya antikorlardır.

Kan grubunun belirlenmesinde olası aglütinasyon türleri

Aglütinasyon spesifiktir ve spesifik değildir. İlk durumda, reaksiyon üç bileşenin katılımıyla gerçekleşir:

• antijenler;
• antikorlar;
• elektrolitler (izotonik çözelti kullanılır).

Kan grubunun belirlenmesinde olası tüm aglütinasyon türleri kullanılır, ancak tek durum bu değildir.

Ne amaçla kullanılır?

Kan aglütinasyon testi, bulaşıcı bir hastalığa neden olan ajanı belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda yerleşir ve tortuda tespit edilmesi kolaydır. Bu süreç, yukarıda bahsedildiği gibi kullanılır ve daha sonra tartışılacak olan budur.

Özellikler nelerdir?

Kırmızı kan hücreleri, A ve B tipi antijenler içerir ve sırasıyla ά ve β antikorlarına bağlanır. Kan grupları ve aglütinasyon reaksiyonları:

• 1, 0 (ά, β) - eritrositlerin yüzeyinde antijen yoktur;
• 2, A (β) - antijen A ve antikor β mevcuttur;
• 3, B (ά) - antijen B ve antikor ά içerir;
• 4, AB (00) - iki antijen var, antikorlar yok.

Antijenlerin zaten embriyoda gözlendiğini belirtmekte fayda var. Antikorlara gelince, doğumdan sonra yaşamın ilk ayında ortaya çıkarlar.

İnsanların uyumluluğu kan grubuna bağlıdır. Fetüsün anne vücudu tarafından reddedilmesinin nedeni budur. Başka bir deyişle, doğmamış çocuğun kan antijenlerine karşı antikorları vardır. Bu durumda uyumsuzluk oluşur. Ayrıca transfüzyon yapılırken kan grubu dikkate alınmalıdır.

Hazırlık

Kan grupları ve aglütinasyon reaksiyonları tıpta sıklıkla kullanılan birbiriyle uyumlu kavramlardır.

Testten önce, belirli talimatları takip etmek önemlidir. Belirli ürünlerin kullanımını geçici olarak hariç tutmak gerekir ve ilaçlar. Bu, sonuçların daha doğru olmasına yardımcı olacaktır. Uyulması gereken öneriler doktor tarafından reçete edilir. Gerçek şu ki, farklı laboratuvarlar elde edilen değerlerin aynı aralıklarına sahip olmayabilir, yani biraz farklılık gösterebilirler.

test için koşullar

Kan grubunun doğru tespit edilebilmesi için doğru ekipman seçimi önemlidir. Bunlar şunları içerir:

• ve pipet;
• cam çubuklar;
• standart izohemaglütinasyon serumları;
• 4 sektöre ayrılan kuru toprak tabaklar.

Test koşulları için gereksinimler vardır:

• gün ışığı;
• odadaki sıcaklık +16 ˚С'nin üzerinde;
• 1:10 oranında kan ve serum hacimlerinin kullanılması;
• Güvenilir sonuçlar 5 dakikada alınır.

Yukarıda ana koşullar ve araçlar bulunmaktadır. Kan aglütinasyonu birkaç şekilde gerçekleştirilebilir ve bunların her biri bireysel gereksinimleri ortaya koyar.

Yöntemler

Aglütinasyon kullanarak kan grubunu belirlemek için olası yöntemler:

• standart yöntem;
• çapraz reaksiyon;
• tsoliklonların kullanımı;
• yöntemi "Erythrotest-Groupcard" setini kullanarak ifade edin.

Standart Yöntem

Kan aglütinasyonu, hastanın kırmızı kan hücreleri kullanılarak kendini gösterir. Bilinen antijenleri içeren standart serumlar da kullanılır.

Düz bir tabağa 1 damla dört serum konur. Daha sonra üzerine cam çubuklar kullanılarak incelenecek hastanın kanı verilir. Bu durumda damlalık kullanmak uygundur. Oran 1:10 olmalıdır. Serum ve kan yavaşça karıştırılır. Beş dakika içinde değerlendirebilirsiniz.

Test sonuçlarını basit bir şekilde deşifre etme

Serum damlalarında belirtilen süreden sonra aydınlanma gözlenir. Bazılarında eritrosit aglütinasyonunun meydana geldiğini (küçük pullar), diğerlerinde olmadığını görebilirsiniz.

Aşağıdaki seçenekler vardır:

• tüm serum örneklerinde reaksiyon yok - grup 1;
• 2 numune dışında her yerde pıhtılaşma meydana geldi - grup 2;
• sadece numune 3 - grup 3'te reaksiyon yok;
• aglütinasyon her yerde meydana geldi - grup 4.

Bu nedenle, asıl mesele serumu uygun şekilde dağıtmaktır. O zaman sonucu deşifre etmek zor olmayacak. Kan aglütinasyonu zayıf ise tekrar test yapılması önerilir. Küçük pullar söz konusu olduğunda, bunlar mikroskop altında incelenir.

çapraz reaksiyon

Bazen basit bir şekilde kan grubunu doğru olarak belirlemek imkansızdır. Bu durumda aglütinasyon, çapraz reaksiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Testin ilk versiyonundan farklı olarak burada standart eritrositler önemlidir. Hastanın kanı bir test tüpüne çekilir, santrifüjlenir ve ardından daha fazla araştırma için bir pipet ile serum pompalanır.

2 damla olacak şekilde bir tabağa konur, üzerine A ve B grubu standart kırmızı kan hücreleri eklenir, içindekiler kap çalkalanarak karıştırılır.

Çapraz reaksiyon yönteminin sonuçları

Beş dakika sonra numuneler inceleme için hazırdır. Seçenekler şunlardır:

• her iki damlada da bağlanma meydana geldi - 1 grup;
• numunelerin hiçbirinde pul gözlenmedi - grup 4;
• süreç bir numunede görülebilir - 2 veya 3 grup (kanın tam olarak nerede pıhtılaştığına bağlı olarak).

Zoliklon yöntemi

Kan grubunu belirlemek için bu şekilde aglütinasyon, sentetik serum ikame maddeleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bunlara tsoliklonlar denir. Eritrotestler (sırasıyla pembe ve mavi) olarak bilinen ά ve β-aglütinler için yapay ikameler içerirler. Reaksiyon, bunlar ve hastanın kırmızı kan hücreleri arasında gerçekleşir.

Bu yöntem en doğru ve güvenilir olanıdır. Temel olarak, yeniden inceleme gerektirmez. Sonuçların değerlendirilmesi, standart yöntemde olduğu gibi yapılır. Tuhaflık, belirli bir sentetik ikame (anti-AB) ile bir reaksiyonla mutlaka doğrulanması gerektiğidir. Ayrıca sodyum klorür çözeltisi eklendiğinde içerisinde herhangi bir yapışma gözlenmez.

Bir dizi "Erythrotest-Groupcards" ile hızlı yöntem

Kan grubunun belirlenmesinde olası analiz yöntemleri göz önüne alındığında, bu yöntemin kendine has özellikleri olduğunu belirtmekte fayda var. Sonucun sadece laboratuvarda değil, sahada da değerlendirilebilmesinde yatmaktadırlar. Çalışma için özel bir set kullanılır. Altta zaten mevcut olan kurutulmuş reaktiflerle bir kuyu kartı içerir. Anti-AB, anti-A ve anti-B'ye ek olarak, Rh faktörünü belirlemek için anti-D kullanılır.

Bu yöntem özel hazırlık gerektirmez, parmaktan alınan kanın kullanılmasına izin verilir, içinde koruyucu bulunmasına izin verilir. İlk olarak, malzemeleri çözmek için her kuyucuğa bir damla su eklemeniz gerekir. Bundan sonra kan eklenir, hafifçe karıştırılır. Üç dakika içinde sonuç alınacak.

yanlış aglütinasyon

Bazen testten sonra elde edilen veriler doğru olmayabilir. Bu fenomen belirli faktörlere bağlıdır.

Üç tür yanlış pozitif vardır:

Psödoaglütinasyon. Gerçek bağlanma oluşmaz, eritrositler basitçe madeni para sütunları şeklinde katlanır. Birkaç damla salin eklerseniz, parçalanırlar. Benzer bir fenomen mikroskop altında tanınır.

Kanın soğuk aglütinasyonu. Çalışma koşulları elverişsiz ise böyle bir reaksiyon gözlenir. Sıcaklık +16 ˚C'nin altına düştüğünde yapışma meydana gelebilir.

Panaglütinasyon. Kanda enfeksiyon varsa test sonuçları yanlış olabilir. Bu fenomen şu durumlarda da mümkündür: onkolojik hastalıklar, sepsis ile.

Aglütinasyon tıpta çok önemlidir. Sadece kan grubunu belirlemeye değil, aynı zamanda hastalıklara neden olan ajanı ve ayrıca enfeksiyonların varlığını belirlemeye de izin verir. Asıl mesele, bu işleme hazırlanırken doktorun tavsiyelerine uymaktır. Sağlık personeline gelince, görevleri uygun koşulları yaratmak ve tüm kurallara uymaktır. İnsan ancak bu şekilde ulaşabilir doğru sonuçlar kan aglütinasyonu yaparken.