Studium biomateriálu pomocí PCR. Diagnostika infekcí pomocí PCR. Jak přesná je diagnostika infekcí?

Stále častěji se v lékařské praxi začal používat nová metoda diagnostika infekční choroby, který má zkratku PCR. Co je podstatou této výzkumné metody a jaké nemoci lze díky ní odhalit a jaké jsou výhody PCR ve srovnání s jinými běžnými diagnostickými metodami a jak se správně připravit na analýzu, se dozvíte v tomto článku .

Co je to PCR?

Zkratka PCR znamená polymerázová řetězová reakce. To je schopnost segmentu DNA množit se proporcionálně, když nutné podmínky. PCR-diagnostika infekcí byla vynalezena již v 80. letech 20. století. Na objevu pracovali evropští, američtí i sovětští vědci, nelze tedy určit průkopníka inovativní diagnostické metody. Kromě toho od roku 1983, kdy byla oficiálně zaregistrována taková metoda pro studium infekčních onemocnění jako PCR, pokračovaly práce na zdokonalování této metody. Dnes se tato diagnostická metoda používá téměř v každé lékařské laboratoři, která má potřebné moderní vybavení.

Jak se provádí analýza?

Pro analýzu PCR v závislosti na lékařské indikace je nezbytný lékařský odběr materiálů, jako je krev, sliny, moč, sperma, mateřské mléko nebo pohlavní sekrety, epitelové buňky. Diagnostika infekcí pomocí PCR spočívá v detekci DNA patogenu v testovaném materiálu. Pomocí speciálních laboratorních manipulací s použitím chemických činidel a zařízení provádějí laboratorní asistenti polymerázovou řetězovou reakci. S jeho pomocí naroste část DNA patogenu, která je v mikroskopu neviditelná, do velikostí, které jsou patrné v zařízení. Proto je možné odhalit původce infekce, i když je v testovaném materiálu nevýznamný úsek jeho DNA.

Jaké infekce lze detekovat pomocí PCR?

Dokáže detekovat řadu patogenních mikroorganismů PCR diagnostika infekcí. Interpretace výsledků se redukuje na detekci patogenu a určení jeho typu. K diagnostice se používá polymerázová řetězová reakce různé nemocičlověk: od pohlavně přenosných po asymptomatické, tzv skryté infekce. PCR zjistila:

• virus hepatitidy (A, B, C);
• ureplasma urealiticum;
• ureplasma parvum;
• Chlamydia trachomatis;
• candida
• mycoplasma hominis;
• mycoplasma genitalium;
• garganella vaginalis;
• trichomoniáza;
• Mycobacterium tuberculosis;
• virus herpes simplex typu 1 a 2;
• papilomavirus;
• virus Epshetain-Barrové;
• helicobacter pylori;
• virus imunodeficience.

Výše uvedené mikroorganismy způsobují onemocnění, jako je hepatitida, tuberkulóza, STI a AIDS.

PCR diagnostika infekcí se provádí formou kvalitativní (to znamená, že se určuje přítomnost nebo nepřítomnost patogenu) a kvantitativní analýzy (počítá se počet mikrobů v těle - tento přístup je nezbytný např. při diagnostice infekcí HIV a hepatitidy).

Výhody diagnostické metody

Téměř každá laboratoř dnes diagnostikuje lidské infekce pomocí polymerázové řetězové reakce. Jaké jsou výhody této metody, proč se za tak krátkou dobu stala neuvěřitelně populární jak mezi lékaři, tak mezi pacienty? Takové rychlé šíření inovativní technologie se vysvětluje vysokou úrovní spolehlivosti, účinnosti a citlivosti. Podívejme se podrobněji na výhody diagnostické metody PCR:

1. Proces analýzy je maximálně automatizován, což eliminuje lidský faktor při studiu a interpretaci výsledku.
2. Díky moderní technologie kultury se pěstují během 4-6 hodin, a proto můžete získat výsledek analýzy v den, kdy je materiál předán k výzkumu.
3. PCR diagnostika infekcí je vysoce citlivá, což umožňuje detekovat patogen i v přítomnosti malého kousku DNA. V některých případech, například u pomalých a asymptomatických onemocnění, je výsev plodin jinou metodou obtížný nebo zcela nemožný.
4. Materiálem pro PCR výzkum může být krev, sliny, urogenitální sekrety, epiteliální buňky, moč, sperma, což je mimořádně výhodné, když není možné odebrat určitý materiál k analýze. Běžně se používá k diagnostice infekčních onemocnění žilní krev a urogenitální stěr.
5. Metodou polymerázové řetězové reakce lze identifikovat několik patogenů ze stejného materiálu. Tento přístup nejen zkracuje dobu řešení správná diagnóza ale také šetří náklady na výzkum.
6. Metoda PCR je považována za spolehlivou, protože byl zaznamenán pouze malý počet falešně negativních výsledků. Dosud nebyly zaznamenány žádné falešně pozitivní odpovědi.

Kdy se používá diagnostika PCR?

Ať už jsou výhody PCR diagnostiky infekcí jakékoli, ne vždy se tato metoda používá. Například při diagnostice toxoplazmózy se polymerázová řetězová reakce provádí pouze v případě, že analýza ELISA ukázala pochybný nebo kontroverzní výsledek. Pomocí metody PCR je nemožné vysledovat dynamiku onemocnění. Poznámka následující případy kdy tato metoda výzkumu přinese spolehlivé a efektivní výsledky:

• určit infekční onemocnění uvedená výše v příslušné části článku;
• rozšířená PCR diagnostika urogenitálních infekcí;
• ke stanovení STI během těhotenství;
• pro diagnostiku HIV;
• v kontroverzních lékařských situacích k potvrzení nebo vyvrácení předběžné diagnózy;
• určit otcovství a rodinné vazby;
• používá se při genotypizaci k detekci dědičných predispozic;
• metoda PCR pomáhá pracovníkům soudního oddělení medicíny identifikovat genetický materiál.

PCR během těhotenství

Vyšetření metodou PCR je pro těhotnou ženu povinné při registraci za účelem včasná diagnóza pohlavně přenosné infekce. Protože taková onemocnění jsou extrémně nebezpečná pro normální průběh období porodu dítěte. STI vyvolávají vyblednutí vývoje plodu, potraty, intrauterinní deformity, mrtvé narození, vrozené patologie. Včasný záchyt a léčba infekce výrazně zvyšuje šance na příznivý výsledek těhotenství a narození zdravého miminka.

Obvykle nastávající matka jmenovaný komplexní vyšetření, která má název „PCR 6“. Taková studie zahrnuje analýzu 6 různých infekcí. PCR diagnostika se provádí ve veřejných i soukromých institucích: tuto službu nabízejí laboratoře Invitro, Happy Family, Uro-Pro a další. Tento problém je podrobněji popsán níže.

Bude tedy nutné vzít materiál k analýze pouze jednou. Při provádění PCR diagnostiky během těhotenství je nutný urogenitální výtěr, který se odebírá z cervikálního kanálu gynekologickým kartáčkem. Tento postup ne bolest u těhotné ženy a nijak neovlivňuje plod.

PCR k určení hepatitidy

K detekci původce hepatitidy je často předepsána PCR diagnostika. To se vysvětluje skutečností, že taková nemoc je často asymptomatická a přechází do chronického těžkého neřešitelného stadia. Pomocí PCR je hepatitida detekována v nejranějších stádiích, což přispívá k příznivému vyléčení v co nejkratším čase. Taková PCR diagnostika infekcí se provádí ve většině soukromých laboratoří. Cena závisí na typu stanovovaného viru a typu analýzy. Takže jednoduché stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti patogenní DNA v krvi stojí 400-600 rublů. Kvantitativní metoda bude stát 1200-1500 rublů.

Komplexní studie pomocí PCR

Pro ještě efektivnější účinnost metody PCR v diagnostice infekčních onemocnění je široce používána komplexní studie, což pomáhá zkrátit dobu diagnózy a včasné léčby. Laboratoře tedy nabízejí analýzu "PCR-6" a "PCR-12". První komplex zahrnuje PCR diagnostiku genitálních infekcí, jako jsou:

• ureplazmóza;
• chlamydie;
• mykoplazmóza;
• lidsky papillomavirus;
• jednoduchý herpes;
• cytomegaloviru.

Taková studie je často přidělena ženám na raná data těhotenství, stejně jako při plánování početí.

Během "PCR-12" jsou kromě výše uvedených onemocnění diagnostikovány:

• kapavka;
• kandidóza;
• bakteriální vaginóza;
• trichomoniáza;
• ureplazmóza;
• herpes 1 a 2 typů.

V závislosti na laboratoři se seznam studovaných onemocnění zahrnutých do komplexu může lišit. V každém vybere lékař konkrétní případ nejvhodnější vyšetření. V každém případě komplexní analýza pomocí PCR zabere mnohem méně času, úsilí a nákladů na materiál.

PCR diagnostika infekcí: jak projít?

Příprava na PCR analýzu spočívá v dodržování doporučení pro odběr určitého typu materiálu:

1. Při absolvování urogenitálního stěru je třeba se zdržet pohlavního styku tři dny před zamýšlenou analýzou, přestat užívat antibakteriální léky a místní masti, krémy, čípky, sprchy by se neměly provádět. Během menstruačního toku se odběr vzorků materiálu neprovádí - je nutné provést analýzu nejdříve 3 dny po skončení menstruace. 3 hodiny před analýzou byste se měli zdržet močení.
2. Žilní krev je lepší darovat ráno, nalačno (i když to není pravidlem). Den předem byste měli omezit konzumaci alkoholu a tučných jídel.
3. Při darování spermatu se musíte tři dny zdržet sexuálního kontaktu. Doporučuje se omezit pití alkoholu, návštěvu sauny, horkou koupel.
4. Moč by se měla odebírat ráno, po důkladné toaletě genitálií. Materiál je lepší sbírat do speciální sterilní nádoby. Materiál by měl být doručen do laboratoře během několika hodin.

Jak dekódovat výsledek?

Po provedení PCR diagnostiky infekcí není obtížné interpretovat výsledky. Dešifrování kvalitativní metody spočívá v posouzení přítomnosti nebo nepřítomnosti patogenu v testovaném materiálu a také v určení typu patogenního mikroorganismu. Pokud byla v testovaném materiálu nalezena část DNA mikroba, zapíše se pozitivní výsledek do příslušného formuláře a také se uvede, jaký typ mikroba byl stanoven. V nepřítomnosti patogenního mikroorganismu v materiálu bude výsledek negativní.

Výsledky kvantitativní analýzy, například při diagnostice hepatitidy, musí být dešifrovány pomocí standardů stanovených laboratoří. Protože jednotky měření a kvantitativní faktor se v různých lékařských diagnostických institucích výrazně liší. Spolehlivě, s přihlédnutím ke všem doprovodným faktorům, může takový rozbor dešifrovat pouze lékař.

V poslední době spolehlivý, vysoce citlivý a rychlá metoda diagnostiku různých lidských infekčních chorob. Tato metoda se nazývá "PCR analýza". její podstatu, jaké mikroorganismy dokáže odhalit a jak ji správně brát, si řekneme v našem článku.

Historie objevů

Metodu polymerázové řetězové reakce (PCR) vynalezl americký vědec Kary Mullis v roce 1983. Původně si ji patentovala společnost Cetus Corporation, ve které její tvůrce pracoval. Ale v roce 1992 byla všechna práva a patenty prodána Hoffman-La Roche. Poté se ukázalo, že podobné studie byly prováděny paralelně a byly zaznamenány dalšími americkými biology, jako jsou Alice Chen, David Edgar, John Trell. V roce 1980 se tímto problémem zabývali i sovětští vědci A. Slyusarenko, A. Kaledin, a proto se ukázalo jako nemožné určit jediného držitele autorských práv. Mnoho významných biochemiků přispělo určitým způsobem k rozvoji polymerázové reakce a patentovalo své inovace. V současné době se PCR analýza provádí všude ve speciálně vybavených laboratořích.

Podstata diagnostické metody PCR

PCR analýza: co to je a jak to funguje? Podstatou metody je zvětšení objemu určitého mikrobiálního prostředí v umělých podmínkách pomocí speciálního enzymu DNA polymerázy. Za tímto účelem se existující materiál DNA mnohonásobně znásobí. V přítomnosti patogenního mikroorganismu ve vzorku se tedy díky biochemickým laboratorním manipulacím zvýší jeho počet a nebude obtížné bakterii pod mikroskopem detekovat.

Jak probíhá materiálový výzkum?

Analýza vyžaduje:

K provedení PCR se provede 25-30 opakování, která se skládají ze tří fází: denaturace, žíhání a elongace.

Pro analýzu polymerní řetězové reakce se používá speciální zařízení - zesilovač. Moderní vybavení umožňuje nastavit potřebný program pro ohřev a chlazení zkumavek pro eliminaci chyb při diagnostice.

Kde se diagnostika používá?

Metoda polymerní řetězové reakce se používá v různých oblastech medicíny:

• forenzní vědci ji používají k identifikaci genetického materiálu, jako jsou vlasy, sliny nebo krev;
• krevní test PCR pomáhá s genotypizací, například k detekci individuální geneticky inherentní reakce na konkrétní lék;
• pomocí této metody se ustavuje přítomnost rodinných vazeb mezi lidmi;
• Nejoblíbenější metodou PCR se stala in lékařská diagnostika k identifikaci různých infekčních onemocnění.

Jaké infekce jsou detekovány pomocí PCR?

Medicína tedy dlouho a úspěšně používá analýzu PCR. Co to je, už víme. A jaké patogeny se s ním dají odhalit? Pomocí PCR se diagnostikují:

V diagnostice rakoviny se také používají metody PCR.

Výhody metody

PCR diagnostika má několik výhod:

Aby byly výsledky spolehlivé PCR studie, musíte projít analýzou podle doporučení pro předběžnou přípravu na diagnostiku:

1. Před darováním slin byste se měli zdržet jídla a užívání léků 4 hodiny před odběrem materiálu. Bezprostředně před zákrokem si vypláchněte ústa převařenou vodou.
2. Výše uvedená pravidla je třeba dodržovat i při odběru vzorku z vnitřního povrchu tváře. Po opláchnutí se doporučuje provést lehkou masáž pokožky, aby se zvýraznilo tajemství žlázy.
3. Moč se obvykle sbírá doma. Chcete-li to provést, musíte provést důkladnou toaletu genitálií. Odeberte 50-60 ml moči do sterilní plastové nádoby. Pro zajištění čistoty materiálu se ženám doporučuje zavádět tampon do pochvy a mužům stahovat kožní řasu co nejdále. Materiál nemůžete vzít během menstruačního toku.
4. Chcete-li darovat sperma, musíte se zdržet pohlavního styku po dobu 3 dnů před odběrem materiálu. Lékaři také nedoporučují navštěvovat saunu a horkou koupel, pít alkohol a kořeněná jídla. 3 hodiny před analýzou se musíte zdržet močení.
5. Například pro dodání urogenitálního stěru, pokud se provádí PCR test na chlamydie, se ženám i mužům doporučuje sexuální klid po dobu 3 dnů. 2 týdny před analýzou nelze provést antibakteriální léky. Přestaňte používat do týdne intimní gely, masti, vaginální čípky, výplachy. 3 hodiny před vyšetřením se musíte zdržet močení. Během menstruace se odběr materiálu neprovádí, pouze 3 dny po ukončení krevní sekrety můžete si vzít urogenitální stěr.

PCR během těhotenství

Během čekání na dítě je mnoho sexuálně přenosných infekcí extrémně nebezpečných pro normální vývoj plodu. STD mohou vyvolat intrauterinní růstovou retardaci, potrat nebo předčasný porod, vrozené malformace dítěte. Proto je nesmírně důležité podstoupit PCR vyšetření v časném těhotenství. Při registraci je nutné absolvovat rozbor - do 12 týdnů.

Materiál se odebírá z cervikálního kanálu pomocí speciálního kartáčku. Zákrok je bezbolestný a pro miminko nepředstavuje nebezpečí. Obvykle se během těhotenství provádí analýza na chlamydie metodou PCR, stejně jako na ureaplasmózu, mykoplazmózu, cytomegalovirus, herpes, papilomavirus. Takový komplex vyšetření se nazývá PCR-6.

PCR pro diagnostiku HIV

Vzhledem k tomu, že metoda polymerázové řetězové reakce je velmi citlivá na změny v těle a podmínky diagnózy, může výsledek ovlivnit mnoho faktorů. Proto PCR analýza pro HIV infekci není spolehlivou metodou, její účinnost je 96-98%. Ve zbývajících 2-4% případů dává test falešně pozitivní výsledky.

Ale v některých situacích se člověk neobejde bez PCR diagnostiky HIV. Obvykle se podává lidem s falešně negativním výsledkem ELISA. Takové indikátory naznačují, že osoba dosud nevyvinula protilátky proti viru a nelze je detekovat bez vícenásobného zvýšení počtu. Právě toho lze dosáhnout provedením krevního testu metodou PCR.

Taková diagnostika je nezbytná i u dětí prvního roku života narozených od HIV pozitivní matky. Metoda je jediný způsob, jak spolehlivě určit stav dítěte.

PCR pro diagnostiku hepatitidy

Metoda polymerázové řetězové reakce umožňuje detekovat DNA viru hepatitidy A, B, C dlouho před tvorbou protilátek proti infekci nebo nástupem příznaků onemocnění. Analýza PCR pro hepatitidu C je zvláště účinná, protože v 85% případů je toto onemocnění asymptomatické a bez včasné léčby přechází do chronického stadia.

Včasná detekce patogenu pomůže vyhnout se komplikacím a dlouhodobé léčbě.

Komplexní PCR vyšetření

Komplexní PCR analýza: vyšetření metodou polymerní řetězové reakce, která zahrnuje stanovení několika typů infekcí současně: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomegalovirus, herpes typu 1 a 2, kapavka, papilomavirus. Cena takové diagnostiky se pohybuje od 2000 do 3500 rublů. v závislosti na klinice, použitých materiálech a vybavení a také na typu analýzy: kvalitativní nebo kvantitativní. Co je ve vašem případě nezbytné - lékař rozhodne. Někde stačí jen zjistit přítomnost patogenu, jinde, např. u HIV infekce, hraje důležitou roli kvantitativní titr. Při diagnostice všech výše uvedených patogenů se vyšetření nazývá „PCR-12 analýza“.

Dešifrování výsledků analýzy

Dešifrování PCR analýzy není obtížné. Existují pouze 2 stupnice indikátoru - "pozitivní výsledek" a "negativní výsledek". Při zjištění patogenu mohou lékaři s 99% jistotou potvrdit přítomnost onemocnění a začít pacienta léčit. U kvantitativní metody stanovení infekce bude odpovídající sloupec udávat číselný ukazatel detekovaných bakterií. Pouze lékař může určit stupeň onemocnění a předepsat potřebnou léčbu.

V některých případech, například při stanovení infekce HIV pomocí PCR, s negativním výsledkem, je nutné provést další vyšetření k potvrzení získaných indikátorů.

Kde vzít analýzu?

Kde vzít analýzu PCR: v státní poliklinika Nebo v soukromé laboratoři? Bohužel v městských zdravotnických zařízeních je vybavení a metody často zastaralé. Proto je lepší dát přednost soukromým laboratořím s moderním vybavením a vysoce kvalifikovaným personálem. Kromě toho v soukromá klinika výsledky dosáhnete mnohem rychleji.

V Moskvě mnoho soukromých laboratoří nabízí PCR analýzu různých infekcí. Například na takových klinikách, jako je Vita, Komplexní klinika, Happy Family, Uro-Pro, se provádí analýza PCR. Cena vyšetření je od 200 rublů. pro identifikaci jednoho patogenu.

Lze konstatovat, že diagnostika infekčních onemocnění pomocí PCR je ve většině případů rychlým a spolehlivým způsobem, jak detekovat patogen v těle v časných stádiích infekce. V určitých případech však stojí za to zvolit jiné diagnostické metody. Pouze odborník může určit potřebu takové studie. Dešifrování PCR analýzy také vyžaduje profesionální přístup. Dodržujte pokyny svého lékaře a neprovádějte testy, které nepotřebujete.