faze aglutinacije. Predavanje iz mikrobiologije „Imunološke reakcije

Reakcija aglutinacije

Aglutinacija (lat. aglutinacija- lijepljenje) - lijepljenje (povezivanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijele ćelije, čestice lateksa i sl.) sa molekulama specifičnih antitijela u prisustvu elektrolita, koje se završava formiranjem ljuskica ili sedimenta (aglutinata) vidljivih za golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelarne bakterije daju sediment velikih pahuljica, flagelarni i bez kapsula - sitnozrnati, kapsularni - žilasti. Razlikovati direktnu aglutinaciju, u kojoj interakcija sa specifičnim antitijelima direktno uključuje vlastite antigene bakterijske ili bilo koje druge ćelije, kao što su eritrociti; i indirektne, ili pasivne, u kojima bakterijske ćelije ili eritrociti, ili čestice lateksa nisu nosioci svojih, već stranih antigena (ili antitela) adsorbovanih na njima da bi otkrili antitela (ili antigene) specifična za njih. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje antitijela koja pripadaju IgG i IgM klasama. Teče u dve faze: prvo, postoji specifična interakcija aktivnog centra antitela sa determinantom antigena, ova faza se može javiti u odsustvu elektrolita i nije praćena vidljivim promenama u reakcionom sistemu. Druga faza, formiranje aglutinata, zahtijeva prisustvo elektrolita koji smanjuju električni naboj kompleksa antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihovog lijepljenja. Ova faza se završava formiranjem aglutinata.

Reakcije aglutinacije se postavljaju ili na staklo ili na glatke kartonske ploče, ili u sterilne aglutinacijske epruvete. Reakcije aglutinacije (direktne i pasivne) na staklu se obično koriste kao ubrzana metoda za otkrivanje specifičnih antitijela u serumu pacijenta (na primjer, kod bruceloze) ili za serološku identifikaciju patogena. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska antitijela ili njihov set na različite antigene. Nesumnjiva prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njegove formulacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, jer se obje komponente u njemu koriste u koncentriranom obliku. Međutim, ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Prošireni test aglutinacije u epruvetama daje preciznije rezultate, jer vam omogućava da odredite kvantitativni sadržaj antitijela u serumu (postavite njegov titar) i, ako je potrebno, registrujete činjenicu povećanja titra antitijela, što je dijagnostički vrijednost. Za uspostavljanje reakcije, u aglutinaciju se uvode serum razrijeđen 0,85% otopinom NaCl na određeni način i jednaka zapremina (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili test kulture) koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml. cijevi. Obračun rezultata reakcije aglutinacije vrši se preliminarno nakon 2 sata inkubacije epruveta na temperaturi od 37°C i konačno nakon 20-24 sata prema dva znaka: prisutnosti i veličini precipitata i stepenu transparentnost supernatanta. Ocjenjivanje se vrši po sistemu četiri ukrštanja. Reakcija je obavezno praćena kontrolom seruma i antigena. U onim slučajevima kada se za serološku identifikaciju patogena koristi detaljan test aglutinacije u epruveti, on ima dijagnostičku vrijednost ako se reakcija ocijeni pozitivnom kada se dijagnostički serum razrijedi sa najmanje polovinom svog titra.

Treba uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i antitijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog se formira samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, sa značajnim viškom antigena ili antitijela, reakcija se ne opaža. Ovaj fenomen se naziva "prozonski fenomen". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji taloženja. Pojava prozona u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih, po pravilu, polideterminantni, a molekuli IgG antitela imaju dva aktivna centra. Sa viškom antitijela, površina svake čestice antigena je prekrivena molekulima antitijela tako da ne ostaju slobodne determinantne grupe, pa drugi, nevezani aktivni centar antitijela ne može stupiti u interakciju s drugom antigenskom česticom i vezati ih jedno za drugo. Formiranje vidljivog aglutinata ili precipitata također se potiskuje viškom antigena, kada nema nijednog slobodnog aktivnog mjesta antitijela, pa se kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećati.

1.1. REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Zbog svoje specifičnosti, lakoće postavljanja i demonstrativnosti, reakcija aglutinacije je postala široko rasprostranjena u mikrobiološkoj praksi za dijagnostiku mnogih zarazne bolesti.

Reakcija aglutinacije zasniva se na specifičnosti interakcije antitijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama (aglutinogeni). Kao rezultat ove interakcije nastaju čestice - aglomerati koji se talože (aglutiniraju) u obliku pahuljica.

U reakciji aglutinacije mogu učestvovati i žive i mrtve bakterije, spirohete, gljive, protozoe, rikecije, kao i eritrociti i druge ćelije. Reakcija se odvija u dvije faze: prva (nevidljiva) specifična, veza antigena i antitijela, druga (vidljiva) nespecifična, vezivanje antigena, tj. formiranje aglutinata.

Aglutinat nastaje kada se jedan aktivni centar bivalentnog antitijela spoji sa determinantnom grupom antigena. Reakcija aglutinacije, kao i svaka serološka reakcija, odvija se u prisustvu elektrolita.

Izvana, manifestacija pozitivne aglutinacijske reakcije je dvostruka. Kod mikroba bez bičeva, koji imaju samo somatski O antigen, same mikrobne ćelije se direktno spajaju. Takva aglutinacija se naziva sitnozrnasta. Održava se u roku od 18 22 sata. v

Flagelirani mikrobi imaju dva antigena somatski O antigen i flagelarni H antigen. Ako se stanice zalijepe zajedno sa flagelama, formiraju se velike labave pahuljice i takva reakcija aglutinacije naziva se krupnozrnasta. Dolazi u roku od 24 sata.

Reakcija aglutinacije može se postaviti kako u svrhu kvalitativnog i kvantitativnog određivanja specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta, tako i u svrhu određivanja vrste izolovanog patogena. v

Reakcija aglutinacije može se podesiti kako u detaljnoj verziji, koja omogućava rad sa serumom razrijeđenim do dijagnostičkog titra, tako iu varijanti postavljanja indikativne reakcije, koja u principu omogućava otkrivanje specifičnih antitijela ili određivanje vrste patogena.

Prilikom postavljanja detaljne reakcije aglutinacije, radi otkrivanja specifičnih antitijela u krvnom serumu ispitanika, test serum se uzima u razrjeđenju 1:50 ili 1:100. To je zbog činjenice da u cijelom ili malo razrijeđenom serumu normalna antitijela mogu biti prisutna u vrlo visokim koncentracijama, a tada rezultati reakcije mogu biti netačni. Materijal za ispitivanje u ovoj varijanti reakcije je krv pacijenta.

Krv se uzima na prazan želudac ili ne ranije od 6 sati nakon obroka (u suprotnom, u krvnom serumu mogu biti kapljice masti koje ga čine zamućenim i neprikladnim za istraživanje). Krvni serum pacijenta se obično uzima u drugoj sedmici bolesti, uzimajući sterilno iz kubitalne vene 3 4 ml krvi (do tog vremena je koncentrisana maksimalna količina specifičnih antitijela). Kao poznati antigen koristi se dijagnostikum pripremljen od ubijenih, ali ne uništenih mikrobnih ćelija određene vrste sa specifičnom antigenskom strukturom.

Prilikom postavljanja detaljne reakcije aglutinacije kako bi se odredila vrsta, tip patogena, antigen je živi patogen izoliran iz test materijala. Poznata su antitijela sadržana u imuno dijagnostičkom serumu. v

Imunološki dijagnostički serum se dobija iz krvi vakcinisanog kunića. Nakon određivanja titra (maksimalno razrjeđenje u kojem se detektiraju antitijela), dijagnostički serum se sipa u ampule uz dodatak konzervansa. Ovaj serum se koristi za identifikaciju po antigenskoj strukturi izolovanog patogena.

OPCIJE REAKCIJE AGLUTINACIJE

U tim reakcijama učestvuju antigeni u obliku čestica (mikrobne ćelije, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni), koji se spajaju sa antitijelima i talože.

Za uspostavljanje reakcije aglutinacije (RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen); 2) antitelo (aglutinin) i 3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).

INDIKATIVNA (PLOČA) REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Približni, ili lamelarni, RA se stavlja na stakalce na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, kap seruma u razrjeđenju 1:10 1:20 i kontrolna kap se nanose odvojeno na staklo pomoću Pasteurove pipete. izotonični rastvor natrijum hlorida. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obe bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir za nekoliko minuta vizuelno, ponekad i sa lupom (x5). Kod pozitivnog RA u kapi sa serumom uočava se pojava velikih i malih ljuskica, a kod negativnog serum ostaje ravnomjerno zamućen.

REAKCIJA INDIREKTNE (PASIVNE) HEMAGLUTINACIJE (RNHA, RPHA)

Reakcija se postavlja: 1) za otkrivanje polisaharida, proteina, ekstrakata bakterija i drugih visoko dispergiranih supstanci, rikecija i virusa, čiji se kompleksi sa aglutininima ne mogu vidjeti kod običnog RA, ili 2) za otkrivanje antitijela u serumu pacijenata na ove visoko dispergovane supstance i najmanji mikroorganizmi.

Pod indirektnom, ili pasivnom, aglutinacijom se podrazumijeva reakcija u kojoj antitijela stupaju u interakciju s antigenima koji su prethodno adsorbirani na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barij oksid itd. ili eritrociti ovna, I (0) ljudske krvne grupe).

U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA), eritrociti se koriste kao nosač. Antigenom napunjeni eritrociti se drže zajedno u prisustvu specifičnih antitela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPHA kao dijagnostikum eritrocita za detekciju antitijela (serodijagnostika). Ako su eritrociti napunjeni antitijelima (dijagnostikum eritrocitnih antitijela), onda se može koristiti za otkrivanje antigena.

Staging. U jamicama polistirenskih tableta pripremite seriju serijskih razrjeđenja seruma. 0,5 ml poznatog pozitivnog seruma dodaje se u pretposljednju jažicu i 0,5 ml fiziološkog rastvora (kontrole) u posljednju. Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razblaženog eritrocitnog dijagnostikuma, promućka i stavi u termostat na 2 sata.

Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, eritrociti se talože na dnu rupe u obliku ravnomjernog sloja ćelija sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom slučaju se talože u obliku gumba ili prstena. .

1.2. REAKCIJA NEUTRALIZACIJE. LIZA,
OPSONOFAGOCITNA REAKCIJA, REAKCIJA PREOSJETLJIVOSTI

REAKCIJA NEUTRALIZACIJE EGZOTOKSINA SA ANTITOKSINOM (RN)

Reakcija se temelji na sposobnosti antitoksičnog seruma da neutralizira djelovanje egzotoksina. Koristi se za titraciju antitoksičnih seruma i određivanje egzotoksina.

Kada se serum titrira, određena doza odgovarajućeg toksina se dodaje različitim razblaženjima antitoksičnog seruma. Uz potpunu neutralizaciju antigena i odsustvo neiskorištenih antitijela, dolazi do početne flokulacije. Reakcija flokulacije može se koristiti ne samo za titraciju seruma (na primjer, kod difterije), već i za titraciju toksina i toksoida. Reakcija neutralizacije toksina antitoksinom je od velike praktične važnosti kao metoda za određivanje aktivnosti antitoksičnih terapijskih seruma. Antigen u ovoj reakciji je pravi egzotoksin.

Jačina antitoksičnog seruma određena je konvencionalnim jedinicama AE.

1 AU botulinum seruma njegova količina neutralizira 1000 DLM botulinum toksina. Reakcija neutralizacije radi određivanja vrste ili vrste egzotoksina (u dijagnostici tetanusa, botulizma, difterije i dr.) može se provesti in vitro (prema Ramonu), a kod određivanja toksičnosti mikrobnih stanica - u gelu ( prema Ouchterlonyju).

Reakcija lize (RL)

Jedno od zaštitnih svojstava imunološkog seruma je njegova sposobnost da otapa mikrobe ili ćelijske elemente koji ulaze u tijelo.

Specifična antitijela koja uzrokuju otapanje (lizu) stanica nazivaju se lizini. Ovisno o prirodi antigena, mogu biti bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini itd.

Lizini pokazuju svoj učinak samo u prisustvu dodatnog faktora - komplementa. Komplement, kao faktor nespecifičnog humoralnog imuniteta, nalazi se u gotovo svim tjelesnim tečnostima, osim u likvoru i tečnosti prednje očne komore. Prilično visok i stalan sadržaj komplementa zabilježen je u ljudskom krvnom serumu i dosta toga u krvnom serumu zamorca. Kod ostalih sisara sadržaj komplementa u krvnom serumu je drugačiji.

Komplement je složen sistem whey proteini. Nestabilan je i kolabira na 55 stepeni 30 minuta. Na sobnoj temperaturi komplement se uništava u roku od dva sata. Vrlo je osjetljiv na dugotrajno mućkanje, na djelovanje kiselina i ultraljubičastih zraka. Međutim, komplement se čuva dugo (do šest mjeseci) u osušenom stanju na niskoj temperaturi. Komplement podstiče lizu mikrobnih ćelija i eritrocita.

Razlikovati reakciju bakteriolize i hemolize.

Suština reakcije bakteriolize je da kada se specifični imunološki serum kombinuje sa odgovarajućim homolognim živim mikrobnim ćelijama u prisustvu komplementa, mikrobi se liziraju.

Reakcija hemolize se sastoji u tome što kada su eritrociti izloženi specifičnom, na njih imunom serumu (hemolitičkom) u prisustvu komplementa, eritrociti se rastvaraju, tj. hemoliza.

Reakcija hemolize u laboratorijskoj praksi koristi se za određivanje tyr komplementa, kao i za uzimanje u obzir rezultata dijagnostičkih testova fiksacije komplementa. Titar komplementa je najmanja količina koja izaziva lizu crvenih krvnih zrnaca u roku od 30 minuta u hemolitičkom sistemu u zapremini od 2,5 ml. Reakcija lize, kao i sve serološke reakcije, događa se u prisustvu elektrolita.

REAKCIJE PREOSJETLJIVOSTI (ALERGIJSKE) REAKCIJE

Određeni oblici antigena, pri ponovljenom kontaktu s tijelom, mogu izazvati reakciju koja je u osnovi specifična, ali uključuje nespecifične ćelijske i molekularne faktore akutnog upalnog odgovora. Poznata su dva oblika hiperreaktivnosti: hipersenzitivnost trenutnog tipa (ITH) i hipersenzitivnost odgođenog tipa (DTH). Prva vrsta reakcije se manifestuje uz učešće antitijela, dok se reakcija razvija najkasnije 2 sata nakon ponovnog kontakta s alergenom. Drugi tip se provodi uz pomoć upalnih T ćelija (Tr3) kao glavnih efektora reakcije, koji osiguravaju nakupljanje makrofaga u zoni upale, reakcija se manifestira nakon 6-8 sati i kasnije.

Nastanku reakcije preosetljivosti prethodi susret sa antigenom i pojava senzibilizacije, tj. pojava antitijela, aktivno senzibiliziranih limfocita i pasivno senzibiliziranih citofilnim antitijelima drugih leukocita (makrofaga, granulocita).

Reakcije preosjetljivosti imaju tri faze razvoja: imunološku; patohemijski; patofiziološki.

U prvoj, specifičnoj fazi, alergen stupa u interakciju s antitijelima i (ili) senzibiliziranim stanicama. U drugoj fazi dolazi do oslobađanja biološki aktivne supstance iz aktiviranih ćelija. Oslobođeni medijatori (histamin, serotonin, leukotrieni, bradikinin itd.) izazivaju različite periferne efekte karakteristične za odgovarajući tip reakcije – treću fazu.

Reakcije preosjetljivosti četvrtog tipa

Reakcije ovog tipa uzrokovane su patogenim međućelijskim interakcijama senzibiliziranih Thelpera, citotoksičnih Tlimfocita (Tkillera) i aktiviranih ćelija mononuklearnog fagocitnog sistema uzrokovane produženom stimulacijom imunološkog sistema bakterijskim antigenima, pri čemu dolazi do relativne insuficijencije imunološkog sustava organizma. sistem za uklanjanje bakterijskih patogena iz unutrašnje sredine zaraznih bolesti. Ove reakcije preosjetljivosti uzrokuju tuberkulozne plućne šupljine, njihovu kazeoznu nekrozu i opću intoksikaciju kod bolesnika s tuberkulozom. Kožna granulomatoza kod tuberkuloze i lepre u morfopatogenetskom smislu je u velikoj meri sastavljena od reakcija preosetljivosti četvrtog tipa.

Najpoznatiji primjer reakcije preosjetljivosti tipa 4 je Mantouxova reakcija, koja se razvija na mjestu intradermalne primjene tuberkulina kod pacijenta čije su tijelo i sistem osjetljivi na mikobakterijske antigene. Kao rezultat reakcije formira se gusta hiperemična papula s nekrozom u centru, koja se pojavljuje samo nekoliko sati kasnije (polako) nakon intradermalne primjene tuberkulina. Formiranje papule počinje izlaskom iz vaskularnog kreveta u međustanične prostore mononuklearnih fagocita cirkulirajuće krvi. Istovremeno počinje emigracija iz vaskularnog korita polimorfonuklearnih ćelija. Zatim se infiltracija neutrofila smanjuje, a infiltrat počinje da se sastoji pretežno od limfocita i mononuklearnih fagocita. To je razlika između Mantouxove i Arthusove reakcije, u kojoj se pretežno polimorfonuklearni leukociti akumuliraju na mjestu lezije.

U reakcijama preosjetljivosti četvrtog tipa, dugotrajna stimulacija senzibiliziranih limfocita antigenima dovodi do patološki intenzivnog i produženog oslobađanja citokina od strane T-pomagača na mjestima patoloških promjena u tkivima. Intenzivno oslobađanje citokina u lokusima oštećenja tkiva uzrokuje hiperaktivaciju ćelija sistema mononuklearnih fagocita koji se tamo nalaze, od kojih mnogi formiraju niti epiteloidnih ćelija u hiperaktiviranom stanju, a neki se međusobno spajaju u gigantske ćelije. Makrofagi, na čijoj su površini izloženi bakterijski i virusni antigeni, mogu se uništiti djelovanjem Tkillera (prirodnih ubica).

Reakcija preosjetljivosti četvrtog tipa je izazvana prepoznavanjem stranog bakterijskog antigena od strane T-pomoćnika koji su senzibilizirani na njega. Neophodan uslov za prepoznavanje je interakcija induktora sa antigenima izloženim na površini ćelija koje predstavljaju antigen nakon endocitoze i obrade stranih imunogena mononuklearnim fagocitima. Drugi neophodno stanje izlaganje antigenima u kombinaciji sa molekulima klase I iz glavnog kompleksa kompatibilnosti tkiva. Nakon prepoznavanja antigena, senzibilizirani pomagači oslobađaju citokine i, posebno, interleukin2, koji aktivira prirodne ubice i mononuklearne fagocite. Aktivirani mononuklearni fagociti oslobađaju proteolitičke enzime i slobodne kisikove radikale koji oštećuju tkiva.

Skinalergijski testovi su testovi za utvrđivanje senzibilizacije organizma na alergene, za određivanje njegove infekcije, na primjer, tuberkuloze, bruceloze, nivoa imuniteta stada, na primjer, na tularemiju. Prema mestu unošenja alergena razlikuju se: 1) kožni testovi; 2) skarifikaciju; 3) intradermalno; 4) potkožni. Klinička reakcija na alergen u kožno-alergijskom testu dijeli se na lokalnu, opću i žarišnu, kao i trenutnu i odgođenu.

Lokalne reakcije medijatorskog tipa HIT javljaju se nakon 5-20 minuta, izražavaju se kao eritem i plikovi, nestaju nakon nekoliko sati, procjenjuju se plus metodom po količini eritema, mjerene u mm. Lokalne reakcije HNL-a nastaju nakon 24-48 sati, traju dugo, pojavljuju se kao infiltrat, ponekad sa nekrozom u centru, a procjenjuju se po veličini infiltrata u mm, također po plus sistemu. Kod citotoksičnih i imunokompleksnih tipova GNT-a, hiperemija i infiltracija se uočavaju nakon 3-4 sata, dostižu maksimum za 6-8 sati i nestaju nakon otprilike jednog dana. Ponekad se uočavaju kombinovane reakcije.

1.3. REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (CFR)

Ova reakcija se koristi za laboratorijska istraživanja za detekciju antitijela u krvnom serumu kod raznih infekcija, kao i za identifikaciju patogena po antigenskoj strukturi.

Test fiksacije komplementa je složen serološki test i karakteriše ga visoka osjetljivost i specifičnost.

Karakteristika ove reakcije je da se promjena antigena tokom njegove interakcije sa specifičnim antitijelima događa samo u prisustvu komplementa. Komplement se adsorbuje samo na kompleksu antitelo-antigen. Kompleks antitijelo-antigen nastaje samo ako postoji afinitet između antigena i antitijela prisutnog u serumu.

Adsorpcija komplementa na kompleksu “antigen antitijela” može utjecati na sudbinu antigena na različite načine, ovisno o njegovim karakteristikama.

Neki od antigena pod ovim uslovima prolaze kroz oštre morfološke promene, sve do rastvaranja (hemoliza, Isaev-Pfeiferov fenomen, citolitičko delovanje). Drugi mijenjaju brzinu kretanja (imobilizacija treponema). Drugi umiru bez oštrih destruktivne promene(baktericidno ili citotoksično djelovanje). Konačno, adsorpcija komplementa možda neće biti praćena promjenama u antigenu koje su lako uočljive.

Prema mehanizmu, RSC se odvija u dvije faze:

1. Prva faza je formiranje kompleksa "antigen antitijela" i adsorpcija na ovom kompleksu komplementa. Rezultat faze nije vizuelno vidljiv (interakcija antigena i antitela uz obavezno učešće komplementa).
2. Druga faza je promena antigena pod uticajem specifičnih antitela u prisustvu komplementa. Rezultat faze može biti vizuelno vidljiv ili ne vidljiv (detekcija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sistema (ovčiji eritrociti i hemolitički serum).

Do uništenja eritrocita hemolitičkim serumom dolazi samo u slučaju vezivanja komplementa za hemolitički sistem. Ako je komplement ranije adsorbiran na kompleksu antigen-antitijelo, tada ne dolazi do hemolize eritrocita.

Rezultat eksperimenta se procjenjuje primjenom prisustva ili odsustva hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom sa potpunim kašnjenjem hemolize, kada je tečnost u epruveti bezbojna i eritrociti se talože na dno, negativnom sa potpunom lizom eritrocita, kada je tečnost intenzivno obojena ("lakirana" krv). Stepen kašnjenja hemolize se procjenjuje ovisno o intenzitetu boje tekućine i količini sedimenta eritrocita na dnu (++++, +++, ++, +).

U slučaju kada promjene u antigenu ostaju nedostupne za vizualno promatranje, potrebno je koristiti drugi sistem koji djeluje kao indikator koji vam omogućava da procijenite stanje komplementa i izvučete zaključak o rezultatu reakcije.

Ovaj indikatorski sistem predstavljaju komponente reakcije hemolize, koje uključuju ovčje eritrocite i hemolitički serum koji sadrži specifična antitijela na eritrocite (hemolizine), ali ne sadrži komplement. Ovaj sistem indikatora se dodaje u epruvete jedan sat nakon postavljanja glavnog CSC-a. Ako je reakcija fiksacije komplementa pozitivna, tada se formira kompleks antitijelo-antigen koji adsorbira komplement na sebe. Pošto se komplement koristi u količini potrebnoj za samo jednu reakciju, a do lize eritrocita može doći samo u prisustvu komplementa, onda kada se on adsorbuje na kompleksu „antigen antitela“ neće doći do lize eritrocita u hemolitičkom (indikatorskom) sistemu. . Ako je reakcija fiksacije komplementa negativna, kompleks “antigen antitijela” se ne formira, komplement ostaje slobodan, a dodavanjem hemolitičkog sistema dolazi do lize eritrocita.

1.4. DNAPROBE. POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA (PCR),
ENZIMSKA IMUNSKA METODA (ELISA), FLUORESCENTNA METODA ANTITIJELA (MFA)

METODE ISPITIVANJA GENOM

Intenzivan razvoj molekularne biologije i stvaranje savršene metodološke osnove za genetička istraživanja postali su osnova genetskog inženjeringa. U oblasti dijagnostike nastao je i ubrzano se razvija pravac za određivanje specifičnih nukleotidnih sekvenci DNK i RNK, takozvano gensko sondiranje. Takve metode se zasnivaju na sposobnosti nukleinskih kiselina da se hibridiziraju i formiraju dvolančane strukture zbog interakcije komplementarnih nukleotida (AT, GC).

Za određivanje željene DNK (ili RNK) sekvence posebno se kreira takozvana polinukleotidna sonda sa specifičnom baznom sekvencom. U njegov sastav uvedena je posebna oznaka koja omogućava identifikaciju formiranja kompleksa.

Iako se gensko sondiranje ne može pripisati metodama imunohemijske analize, njegov glavni princip (interakcija komplementarnih struktura) se metodički provodi na isti način kao indikatorske metode imunodijagnostike. Osim toga, metode genskog sondiranja omogućavaju popunjavanje informacija o infektivnom agensu u odsustvu njegove fenotipske ekspresije (virusi ugrađeni u genom, "tihi" geni).

Za analizu DNK, uzorak se podvrgava denaturaciji kako bi se dobile jednolančane strukture s kojima reagiraju molekuli DNK ili RNA sonde. Za pripremu sondi koriste se ili različiti dijelovi DNK (ili RNK) izolirani iz prirodnog izvora (na primjer, jedan ili drugi mikroorganizam), obično predstavljeni kao genetske sekvence kao dio vektorskih plazmida, ili kemijski sintetizirani oligonukleotidi. U nekim slučajevima se kao sonda koriste preparati genomske DNK hidrolizovane u fragmente, ponekad preparati RNK, posebno često ribosomska RNK. Isti indikatori se koriste kao oznaka, kao u razne vrste imunohemijske analize: radioaktivni izotopi, fluoresceini, biotop (sa daljom manifestacijom kompleksom avidinenzima) itd.

Redoslijed analize određen je svojstvima dostupne sonde

Trenutno se sve više koriste komercijalni kompleti koji sadrže sve potrebne sastojke.

U većini slučajeva, postupak analize se može podijeliti u sljedeće faze: priprema uzorka (uključujući ekstrakciju i denaturaciju DNK), fiksiranje uzorka na nosač (najčešće filter od polimerne membrane), predhibridizacija, sama hibridizacija, ispiranje nevezanih proizvoda, detekcija. U nedostatku standardnog preparata DNK ili RNK sonde, prvo se dobije i označi.

Za pripremu uzorka, možda će biti potrebno "uzgojiti" testni materijal kako bi se identificirale pojedinačne bakterijske kolonije ili povećala koncentracija virusa u ćelijskoj kulturi. Također se provodi direktna analiza uzoraka krvnog seruma, urina, krvnih stanica ili pune krvi na prisustvo infektivnog agensa. Za oslobađanje nukleinskih kiselina iz sastava ćelijske strukture vrši se ćelijska liza, au nekim slučajevima preparat DNK se pročišćava fenolom.

Denaturacija DNK, odnosno njen prelazak u jednolančani oblik, dešava se tokom tretmana alkalijom. Uzorak nukleinske kiseline se zatim fiksira na nitrocelulozni ili najlonski membranski nosač, obično inkubacijom od 10 minuta do 4 sata na 80°C pod vakuumom. Nadalje, u procesu prehibridizacije, postiže se inaktivacija slobodnih veznih mjesta kako bi se smanjila nespecifična interakcija sonde sa membranom. Proces hibridizacije traje od 2 do 20 sati, ovisno o koncentraciji DNK u uzorku, koncentraciji korištene sonde i njenoj veličini.

Nakon što se hibridizacija završi i nevezani proizvodi se isperu, detektuje se nastali kompleks. Ako sonda sadrži radioaktivnu oznaku, tada se membrana izlaže fotografskom filmu kako bi se manifestirala reakcija (autoradiografija). Za druge oznake koristite odgovarajuće postupke.

Najperspektivnija je proizvodnja neradioaktivnih (tzv. hladnih) sondi. Na istoj osnovi razvija se tehnika hibridizacije koja omogućava utvrđivanje prisustva patogena u preparatima rezova, punkcijama tkiva, što je posebno važno u patomorfološkoj analizi (in situ hibridizacija).

Bitan korak u razvoju metoda genskog sondiranja bila je upotreba reakcije amplifikacije polimeraze (PCR). Ovaj pristup omogućava povećanje koncentracije specifične (prethodno poznate) sekvence DNK u uzorku sintetiziranjem više kopija in vitro. Za izvođenje reakcije, preparat enzima DNK polimeraze, višak deoksinukleotida za sintezu i tzv. prajmera, dvije vrste oligonukleotida od 20-25 baza koje odgovaraju krajnjim dijelovima DNK sekvence od interesa, dodaju se u DNK uzorak koji se proučava. Jedan od prajmera mora biti kopija početka regiona za čitanje kodirajućeg lanca DNK u 53 smjeru čitanja, a drugi mora biti kopija suprotnog kraja nekodirajućeg lanca. Zatim, sa svakim ciklusom reakcije polimeraze, broj kopija DNK se udvostručuje.

Za vezivanje prajmera potrebna je denaturacija (tapanje) DNK na 94°C, nakon čega sledi dovođenje smeše na 4055°C.

Za izvođenje reakcije dizajnirani su programibilni inkubatori za mikrouzorke da lako mijenjaju temperaturne promjene koje su optimalne za svaku fazu reakcije.

Reakcija amplifikacije može značajno povećati osjetljivost analize tokom sondiranja gena, što je posebno važno pri niskim koncentracijama infektivnog agensa.

Jedna od značajnih prednosti sondiranja gena sa amplifikacijom je mogućnost proučavanja submikroskopske količine patološkog materijala.

Još jedna karakteristika metode, važnija za analizu infektivnog materijala, je mogućnost otkrivanja skrivenih (tihi) gena. Metode vezane za primjenu genskog sondiranja sigurno će se sve više uvoditi u praksu dijagnosticiranja zaraznih bolesti kako budu sve jednostavnije i jeftinije.

ELISA i RIF metode su uglavnom kvalitativne ili polukvantitativne. Pri vrlo niskim koncentracijama komponenti, formiranje kompleksa antigen-antitijelo ne može se registrirati ni vizualno ni jednostavnim instrumentalnim sredstvima. Indikacija kompleksa antigena antitijela u takvim slučajevima može se provesti ako jedna od inicijalnih komponenti antigena ili antitijela unese oznaku koja se može lako detektirati u koncentracijama usporedivim s koncentracijom analita koji treba odrediti.

Radioaktivni izotopi (na primjer, 125I), fluorescentne tvari i enzimi mogu se koristiti kao oznaka.

Ovisno o korištenoj oznaci, razlikuju se radioimune (RIA), fluorescentne imunološke (FIA), enzimske imunoesejske (ELISA) metode analize itd. poslednjih godinaširok praktična upotreba dobio ELISA, što je povezano sa mogućnošću kvantitativnog određivanja, visokom osjetljivošću, specifičnošću i automatizacijom računovodstva.

ELISA metode analize grupa metoda koje omogućavaju detekciju kompleksa antigena antitijela korištenjem supstrata koji se cijepa enzimom sa pojavom boje.

Suština metode je u kombinaciji komponenti reakcije antigena antitijela sa izmjerenom oznakom enzima. Antigen ili antitijelo koje reaguje označeno je enzimom. Po transformaciji supstrata pod dejstvom enzima može se suditi o količini komponente reakcije antigen-antitelo koja je ušla u interakciju. Enzim u ovom slučaju služi kao marker imunološkog odgovora i omogućava vam da ga promatrate vizualno ili instrumentalno.

Enzimi su vrlo zgodne oznake jer im njihova katalitička svojstva omogućavaju da djeluju kao pojačivači, budući da jedna molekula enzima može proizvesti više od 1 x 105 molekula katalitičkog proizvoda u minuti. Neophodno je odabrati enzim koji dugo zadržava svoju katalitičku aktivnost, ne gubi je kada se veže za antigen ili antitijelo i ima visoku specifičnost u odnosu na supstrat.

Glavne metode za dobijanje antitela ili antigena obeleženih enzimom, konjugati: hemijski, imunološki i genetski inženjering. Za ELISA se najčešće koriste enzimi: peroksidaza rena, alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.

Za otkrivanje aktivnosti enzima u kompleksu antigen-antitijelo u svrhu vizualne i instrumentalne registracije reakcije koriste se kromogeni supstrati čiji rastvori, u početku bezbojni, dobijaju boju tokom enzimske reakcije čiji intenzitet je proporcionalna količini enzima. Tako se za otkrivanje aktivnosti peroksidaze hrena u čvrstoj fazi ELISA kao supstrat koristi 5aminosalicilna kiselina koja daje intenzivnu smeđu boju, ortofenilendiamin, koji formira narandžastožutu boju. Za otkrivanje aktivnosti alkalne fosfataze i ?galatozidaze koriste se nitrofenilfosfati i nitrofenilgalaktozidi.

Rezultat reakcije u formiranju obojenog proizvoda određuje se vizualno ili pomoću spektrofotometra koji mjeri apsorpciju svjetlosti određene valne dužine.

Postoji mnogo opcija za postavljanje ELISA testa. Postoje homogene i heterogene varijante.

Prema načinu postavljanja razlikuju se kompetitivne i nekonkurentne ELISA metode. Ako je u prvoj fazi samo analizirano jedinjenje i njegovi odgovarajući centri vezivanja (antigen i specifična antitela) prisutni u sistemu, onda je metoda nekonkurentna. Ako su analizirano jedinjenje (antigen) i njegov analog (antigen obeležen enzimom) prisutni u prvoj fazi, koji se međusobno nadmeću za vezivanje za specifične centre vezivanja (antitela) prisutna u nedostatku, tada je metoda konkurentna. U ovom slučaju, što više test antigena sadrži rastvor, to je manja količina vezanih obeleženih antigena.

FLUORESCENTNA METODA ANTITIJELA (MFA) ili IMUNOLUORESCENTNE REAKCIJE (RIF)

Imunofluorescentna metoda je metoda izbora za brzo otkrivanje i identifikaciju nepoznatog mikroorganizma u ispitivanom materijalu.

Ag + AT + elektrolit = UV svjetleći kompleks

Mikrobni serum označen fluorohromom

Boja fluorescein izotiocijanat se često koristi FITC

U ovoj studiji se koristi fluorescentni mikroskop.

RIF inscenacija

30 µl otopine FITC-obilježenih antitijela nanese se na razmaz.

Stavite čašu u vlažnu komoru i inkubirajte na sobnoj temperaturi 20-25 minuta, ili u termostatu na 37°C 15 minuta.

Ispirite čašu tekućom vodom iz slavine 2 min, isperite destilovanom vodom i osušite na vazduhu.

Kap tečnosti za montažu nanosi se na osušeni razmaz, razmaz se prekriva zaštitnim staklom i mikroskopira pomoću fluorescentnog mikroskopa ili fluorescentnog nastavka na konvencionalni optički mikroskop.

Reakcija aglutinacije.

Reakcija aglutinacije je adhezija i precipitacija mikrobnih ili drugih stanica (eritrocita) pod djelovanjem antitijela u prisustvu elektrolita. Vidljivi efekat reakcije (fenomen aglutinacije) je stvaranje taloga koji se naziva aglutinat.

Ova reakcija se koristi za serodijagnostika I seroididentifikacija. RA se koristi za serodijagnostiku (otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata) tifusne groznice i paratifus(Vidal reakcija), bruceloza(reakcija Wrighta), tularemija i leptospiroza. RA se koristi za seroidifikaciju (određivanje vrste patogena izolovanog od pacijenta) kada crijevne infekcije veliki kašalj, kolera i sl.

Komponentereakcije:

1. A antigen (aglutinogen) - to su cijele (ne uništene) mikrobne ili druge ćelije ( korpuskularno, nerastvorljivi antigen). Aglutinogeni- to je suspenzija živ ili ubijen mikrobne ćelije ili bilo koje druge ćelije. Antigeni mogu biti nepoznati ili poznati. Nepoznati aglutinogen je mikrobna kultura izolirana iz tijela pacijenta koju treba odrediti. poznati antigen. diagnosticum- dijagnostički lijek - suspenzija mrtvih mikrobi poznate vrste u fiziološkom rastvoru. Ova suspenzija maglovito (providno)), jer mikrobne ćelije se ne rastvaraju, već ostaju netaknute. Poznati aglutinogen će se koristiti za otkrivanje nepoznatih antitijela u serumu pacijenta.

2. Antitijelo (aglutinin)- nalazi se u krvnom serumu. Antitijela također mogu biti nepoznata ili poznata. U krvnom serumu nalaze se nepoznata antitijela koja treba odrediti bolesna osoba. Poznata antitela se nalaze u imunološki dijagnostički serumi, koji se zovu aglutinirajući serumi. Koriste se za seroidifikaciju, tj. za određivanje nepoznatog antigena – vrste mikrobne kulture.

3. Elektrolit- 0,9% rastvor natrijum hlorida.

Načini postavljanja RA.

1. Približan (ploča) RA- izvedeno na staklu. Nanesite 2 kapi seruma i 1 kap izotonične otopine na predmetno staklo. Mikrobna kultura se petljom unosi u jednu od kapi seruma i u kap izotonične otopine i miješa. Kap izotonične otopine sa klicama – kontrola antigena, kap serumi bez klica – kontrola antitela, kap serum sa mikrobima – iskustvo. Ako serum sadrži antitijela koja odgovaraju mikrobnim antigenima koji su pomiješani s njim, tada će se antitijela i antigeni specifično vezati jedni za druge i nakon 1-3 minute u eksperimentalnoj kapi će se pojaviti aglutinatne ljuspice. Kontrola antigena treba da bude mutna, a kontrola antitela bistra. Obračun rezultata reakcije vrši se pojavom pahuljica aglutinata . Ako ispadnu pahuljice, reakcija je pozitivna, tj. antigen odgovara antitelu, a antigen se može koristiti za identifikaciju antitela, ili obrnuto. Ako zamućenost ostane, reakcija je negativna.

2. Produžena reakcija aglutinacije - izvedeno u epruvetama. Prvo se pripremaju 2-struka razrjeđenja krvnog seruma bolesne osobe od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida se sipa u 6 epruveta. U prvu epruvetu se dodaje 1 ml pacijentovog krvnog seruma u razrjeđenju 1:50, miješa se i dobije se razrjeđenje 1:100, a zatim se 1 ml razrijeđenog 1:100 prenosi u drugu epruvetu. i dobije se razrjeđenje 1:200 itd. Ostavljene su dvije epruvete za kontrolu antigena i seruma. Kontroli seruma dodaje se samo serum razrijeđen 1:50, kontroli antigena se dodaje samo antigen. 0,1 ml antigena - diagnosticuma (O- ili H-) dodaje se u sve ostale epruvete i sve epruvete se stavljaju u termostat na 37°C na 18-20 sati. Obračun rezultata reakcije vrši se prema prirodi, količini nastalog taloga (aglutinata) i stepenu zamućenosti. Obračun se vrši samo sa sljedećim rezultatima u kontrolama: kontrola seruma - providna, kontrola antigena - zamućena. O-antitijela daju fino zrnati precipitat. H-antitijela - krupno zrnasta. Prema posljednjoj epruveti, u kojoj je još uvijek vidljiva reakcija aglutinacije, postavljeno dijagnostički titar.

Prilikom serodijagnostike bolesti važno je ne samo otkriti specifična antitijela na određeni patogen, već i njihov broj, tj. ustanoviti takav titar antitijela kada možemo govoriti o prisutnosti bolesti uzrokovane ovim patogenom. Ovaj titar se naziva dijagnostički titar. Na primjer, za dijagnosticiranje trbušnog tifusa potrebno je otkriti titar antitijela 1:400, ali ne manje. Još precizniji rezultati se dobijaju detekcijom povećanja antitela u parnim serumima.Serum pacijenta se uzima na početku bolesti i nakon 3-5 ili više dana. Ako se titar antitijela poveća za najmanje 4 puta, onda možemo govoriti o trenutnoj bolesti.

Cilj: Ovladati tehnikom insceniranja reakcije aglutinacije i precipitacijske reakcije za dijagnostiku zaraznih bolesti.

Modul 1 Morfologija i fiziologija mikroorganizama. Infekcija. Imunitet.

Tema 16: Reakcija aglutinacije. reakcija precipitacije.

Relevantnost teme. Ispod imunitet podrazumijevaju imunitet organizma na infektivne i neinfektivne agense (patogene mikroorganizme, strane proteine ​​i druge tvari). Ovi agensi se nazivaju antigeni. Imunitet je ili urođen ili stečen. Kongenitalno- kada se formiraju tkivni i humoralni zaštitni uređaji koji izazivaju imunitet na zarazne bolesti koje su naslijeđene.

Stečeno- provodi ga imunološki sistem organizma u obliku proizvodnje antitijela ili nakupljanja senzibiliziranih limfocita. Podijeljen je na prirodni i veštački. Prema mehanizmu djelovanja dijeli se na aktivni i pasivni. U svim imunološkim reakcijama glavna komponenta je antigen.

glavna funkcija imunološki sistem, koji se sastoji od limfoidnog tkiva, je prepoznavanje stranih agenasa (antigena) i njihova neutralizacija.

Antigeni mogu ući u organizam putem Airways, digestivnog trakta, preko kože i sluzokože. Svaki antigen stimulira stvaranje specifičnih proteinskih supstanci - antitijela.

Antigeni dijele se na potpune i inferiorne (haptene). Kompletni antigeni izazvati potpuni imunološki odgovor. Defektni antigeni ne izazivaju nezavisno imuni odgovor, ali ponekad stiču ovu sposobnost kada su konjugirani sa proteinskim nosačima visoke molekularne težine. Osim toga, postoje i antigeni: poluhapteni, proantigeni, heteroantigeni i izoantigeni.

Antitela su humani ili životinjski serumski imunoglobulini. Antitijela nastaju nakon infekcije, a kao rezultat imunizacije oslabljenim ili ubijenim bakterijama, rikecijama, virusima, toksinima i drugim agensima. Antitela- proteini imunoglobulina hemijski sastav pripadaju glikoproteinima. Prema strukturi i imunobiološkim svojstvima, imunoglobulini se dijele na 5 klasa: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normalna antitela nalazi se kod ljudi i životinja koje nisu imunizirane. Specifična antitela nastaju kao rezultat infekcije ili imunizacije.

Reakcija između antitijela i antigena naziva se serološki. Serološke reakcije su vrlo specifične i koriste se u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti. Postoje reakcije aglutinacije i precipitacije.

1. Reakcija aglutinacije (RA) zasniva se na interakciji antigena (aglutinogena) i antitijela (aglutinina), u kojoj dolazi do aglutinacije i taloženja mikrobnih tijela u prisustvu elektrolita. Postoje različite modifikacije formulacije reakcije aglutinacije.

Najviša vrijednost imati:

- Makroskopska (razmještena) aglutinacija u epruvetama. Pacijentovom serumu se dodaje suspenzija mikroba (diagnosticum), a nakon 1 sata u termostatu na temperaturi od 37 stepeni, bilježi se razrjeđenje (titar) seruma pri kojem je došlo do reakcije. Reakcija aglutinacije se smatra pozitivnom kada se na dnu epruvete formira precipitat uz izraženo bistrenje supernatanta. Ovaj talog se naziva aglutinat.

Prema prirodi aglutinata razlikuju se finozrnasta (O) i krupnozrna (H) aglutinacija. Za otkrivanje sitnozrnastog aglutinata koristi se aglutinoskop. Obračun rezultata počinje s kontrolnim epruvetama. Posljednje razrjeđenje seruma u kojem je uočena aglutinacija smatra se njegovim titrom.

Svrha reakcije: otkrivanje antitijela u serumu pacijenta.

- mikroskopski (ubrzani) ) približna aglutinacija na staklu. Kap bakterijske kulture dodaje se kapi dijagnostičkog imunološkog seruma i ravnomjerno miješa. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi nakon 5-10 minuta. Zatim se pravi račun. Uz pozitivnu reakciju u kapi seruma, primjećuje se nakupljanje bakterija u obliku zrnaca ili pahuljica. Svrha reakcije: utvrditi vrstu patogena prema poznatom dijagnostičkom serumu.

- Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RNGA). Suština ove reakcije leži u činjenici da ovnski eritrociti mogu adsorbirati antigene na svojoj površini. Pod uticajem specifičnih antitijela, eritrociti se spajaju i talože, formirajući na dnu hemaglutinat. Reakcija je vrlo osjetljiva i specifična. RNGA vam omogućava da otkrijete minimalni iznos antitijela i defektni polisaharidni antigeni. Ova reakcija se koristi u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti (abdominalnih i tifus, paratifus, tuberkuloza itd.).

2. Reakcija precipitacije (RP ) – precipitacija kompleksa antigen-antitijelo. Glavna razlika između RP i RA je u tome što se kod RA koristi korpuskularni antigen, dok je kod RP antigen koloidna supstanca proteinske ili polisaharidne prirode. U ovoj reakciji, antigen se naziva precipitogen, a antitijela se nazivaju precipitini. Reakcija se stavlja u epruvete nanošenjem rastvora antigena na imuni serum. Sa optimalnim omjerom antigena i antitijela na granici

ovi rastvori formiraju taložni prsten. Ako se kao antigen koriste prokuvani i filtrirani ekstrakti organa i tkiva, reakcija se naziva reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, koja se stavlja u dijagnostiku). antraks, kuga, tularemija, itd.).

Široka upotreba dobijene reakcije taloženja u agaru: metoda jednostavne difuzije, metoda dvostruke difuzije.

Vrsta padavina je reakcija flokulacije- za određivanje aktivnosti toksoida ili antitoksičnog seruma. Osim toga, ova reakcija se može koristiti za određivanje toksičnosti sojeva Corynebacterium diphtheriae.

Specifični ciljevi:

· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunog odgovora;

· Opisati strukturu antigena, uključujući antigene mikroorganizama;

· Opisati mehanizam reakcije aglutinacije;

· Opisati mehanizam reakcije taloženja.

biti u mogućnosti da:

· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunog odgovora;

Opisati strukturu antitijela (različite klase imunoglobulina);

· Analizirati mehanizam interakcije antitela sa antigenima;

· Interpretirati rezultate reakcije aglutinacije;

· Interpretirati rezultate reakcije taloženja;

· Analizirati rezultate.

Teorijska pitanja:

1. Definicija pojma "antigeni", "antitijela".

2. Uloga antigena kao induktora imunog odgovora.

3. Struktura antitela (različite klase imunoglobulina).

4. Mehanizam interakcije antitela sa antigenima.

5. Reakcije imunog sistema, njihova uloga u imunološkom odgovoru i dijagnostici zaraznih bolesti.

6. Mehanizam reakcije aglutinacije.

7. Mehanizam reakcije taloženja.

Praktični zadaci koji se izvode u učionici:

1. Postavljanje reakcije aglutinacije za otkrivanje antitijela u serumu pacijenta.

2. Postavljanje reakcije mikroaglutinacije na staklu sa dijagnostičkim serumima za identifikaciju čiste bakterijske kulture.

3. Procjena rezultata reakcije aglutinacije.

4. Postavljanje precipitacijske reakcije za detekciju bakterijskog antigena.

5. Procjena rezultata reakcije taloženja.

6. Procjena rezultata reakcije indirektne hemaglutinacije.

7. Registracija protokola.

književnost:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologija sa virusologijom i imunologijom - Kijev: Viša škola, 1992.- 431 str.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologija.- M.: Medicina, 1998.- 336s.

3. Medicinska mikrobiologija /Uredio V.P. Pokrovsky - M.: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, imunologija i virologija / Udžbenik za medicinske univerzitete, Sankt Peterburg: "Specijalna literatura", 1998.- 592 str.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologija / Udžbenik - 2. izd., revidirano. i dodaj - M.: Medicina, 1983.- 512s.

6. Bilješke sa predavanja.

Dodatna literatura:

1. Titov M.V. zarazne bolesti.- K., 1995.- 321 str.

2. Šuvalova E.P. Infektivne bolesti - M.: Medicina, 1990. - 559s.

Aglutinacija krvi je aglutinacija i sedimentacija crvenih krvnih zrnaca, bakterija i drugih stanica koje nose antigene.

Proces se odvija pod uticajem aglutinina, koji su specifične supstance. Uloga ovih supstanci su lektini ili antitijela.

Moguće vrste aglutinacije u određivanju krvne grupe

Aglutinacija je specifična i nespecifična. U prvom slučaju, reakcija se odvija uz učešće tri komponente:

• antigeni;
• antitijela;
• elektroliti (koristi se izotonični rastvor).

U određivanju krvne grupe koriste se sve moguće vrste aglutinacije, ali to nije jedini slučaj.

U koju svrhu se koristi?

Test aglutinacije krvi koristi se za identifikaciju uzročnika zarazne bolesti. Istovremeno se taloži i lako ga je otkriti u sedimentu. Ovaj proces se koristi, kao što je već spomenuto, i o tome će se dalje govoriti.

Koje su karakteristike?

Crvena krvna zrnca sadrže antigene tipa A i B. Oni se vezuju za ά i β antitela, respektivno. Krvne grupe i reakcije aglutinacije:

• 1, 0 (ά, β) - nema antigena na površini eritrocita;
• 2, A (β) - antigen A i antitelo β su prisutni;
• 3, B (ά) - sadrži antigen B i antitelo ά;
• 4, AB (00) - dva antigena su prisutna, antitela su odsutna.

Vrijedi napomenuti da se antigeni već primjećuju u embriju. Što se tiče antitela, ona se pojavljuju nakon rođenja, u prvom mesecu života.

Kompatibilnost ljudi ovisi o krvnoj grupi. To je razlog odbacivanja fetusa od strane majčinog tijela. Drugim riječima, ona ima antitijela na krvne antigene nerođenog djeteta. U ovom slučaju dolazi do nekompatibilnosti. Osim toga, kod transfuzije se mora uzeti u obzir krvna grupa.

Priprema

Krvne grupe i reakcije aglutinacije su kompatibilni koncepti koji se često koriste u medicini.

Prije testiranja važno je slijediti određena uputstva. Potrebno je privremeno isključiti upotrebu određenih proizvoda i lijekovi. To će pomoći da rezultati budu precizniji. Preporuke koje treba poštovati propisuje lekar. Činjenica je da različite laboratorije možda nemaju iste opsege dobijenih vrijednosti, odnosno neznatno se razlikuju.

Uslovi za testiranje

Da bi se krvna grupa mogla točno odrediti, važno je odabrati pravu opremu. To uključuje:

• i pipeta;
• Staklene šipke;
• standardni izohemaglutinirajući serumi;
• suhe zemljane ploče, koje su podijeljene u 4 sektora.

Postoje zahtjevi za uslove testa:

• dnevna svjetlost;
• temperatura u prostoriji je iznad +16 ˚S;
• korištenje volumena krvi i seruma u omjeru 1:10;
• Pouzdani rezultati se postižu u roku od 5 minuta.

Iznad su navedeni glavni uslovi i alati. Aglutinacija krvi može se provesti na nekoliko načina, a svaki od njih postavlja individualne zahtjeve.

Metode

Moguće metode za određivanje krvne grupe pomoću aglutinacije:

• standardna metoda;
• unakrsna reakcija;
• upotreba tsoliklona;
• ekspresnom metodom koristeći set "Erythrotest-Groupcard".

Standardna metoda

Aglutinacija krvi se manifestuje korišćenjem crvenih krvnih zrnaca pacijenta. Koriste se i standardni serumi koji sadrže poznate antigene.

Na ravnu ploču stavlja se 1 kap od četiri seruma. Zatim se pomoću staklenih štapića u nju unosi krv pacijenta za pregled. U ovom slučaju, zgodno je koristiti kapaljke. Omjer bi trebao biti 1:10. Serum i krv se lagano pomiješaju. U roku od pet minuta možete procijeniti.

Dešifriranje rezultata testa na jednostavan način

Nakon navedenog vremena u kapima seruma, uočava se prosvjetljenje. Kod nekih možete vidjeti da je došlo do aglutinacije eritrocita (male ljuspice), u drugima je nema.

Postoje sljedeće opcije:

• nema reakcije u svim uzorcima seruma - grupa 1;
• koagulacija je bila svuda, osim kod 2 uzorka - grupa 2;
• nema reakcije samo u uzorku 3 - grupa 3;
• aglutinacija je bila posvuda - grupa 4.

Dakle, glavna stvar je pravilno rasporediti serum. Tada neće biti teško dešifrirati rezultat. Ako je aglutinacija krvi slaba, preporučuje se ponovni test. U slučaju malih pahuljica, one se ispituju pod mikroskopom.

unakrsna reakcija

Ponekad na jednostavan način nemoguće je precizno odrediti krvnu grupu. Aglutinacija se u ovom slučaju provodi metodom unakrsne reakcije. Za razliku od prve verzije testa, ovdje su važni standardni eritrociti. Krv pacijenta se vadi u epruvetu, centrifugira, a zatim se serum ispumpava pipetom radi daljeg istraživanja.

Stavlja se na tanjir u količini od 2 kapi, zatim mu se dodaju standardna crvena krvna zrnca grupe A i B. Sadržaj se promeša protresanjem posude.

Rezultati metode unakrsne reakcije

Nakon pet minuta, uzorci su spremni za pregled. Opcije su:

• došlo je do spajanja u obje kapi - 1 grupa;
• pahuljice nisu uočene ni u jednom uzorku - grupa 4;
• proces je vidljiv u jednom uzorku - 2 ili 3 grupe (u zavisnosti od toga gde se tačno krv zgrušala).

Zoliclone Method

Da bi se odredila krvna grupa, aglutinacija se na ovaj način provodi korištenjem sintetičkih nadomjestaka seruma. Zovu se tsoliklones. Sadrže umjetne zamjene za ά i β-aglutine poznate kao eritrotesti (ružičaste i plave, respektivno). Reakcija se javlja između njih i crvenih krvnih zrnaca pacijenta.

Ova metoda je najpreciznija i najpouzdanija. U osnovi, ne zahtijeva ponovno ispitivanje. Procjena rezultata se vrši na isti način kao iu slučaju standardne metode. Posebnost je u tome što se nužno mora potvrditi reakcijom sa specifičnom sintetičkom zamjenom (anti-AB). Osim toga, u njemu se ne primjećuje lijepljenje kada se doda otopina natrijum hlorida.

Ekspresna metoda sa setom "Erythrotest-Groupcards"

S obzirom na moguće metode analize u određivanju krvne grupe, vrijedi napomenuti da ova metoda ima svoje karakteristike. Oni leže u činjenici da se rezultat može procijeniti ne samo u laboratoriji, već i na terenu. Za studiju se koristi poseban set. Sadrži karticu bunara sa osušenim reagensima koji su već prisutni na dnu. Pored anti-AB, anti-A i anti-B, anti-D se koristi za određivanje Rh faktora.

Ova metoda ne zahtijeva posebnu pripremu, dopušteno je koristiti krv uzetu iz prsta, dopušteno je prisustvo konzervansa u njoj. Prvo morate dodati kap vode u svaki bunar da se sastojci otopi. Nakon toga se dodaje krv, lagano promiješa. Rezultat će biti primljen za tri minuta.

Lažna aglutinacija

Ponekad podaci dobijeni nakon testa nisu tačni. Ovaj fenomen zavisi od određenih faktora.

Postoje tri vrste lažnih pozitivnih rezultata:

Pseudoaglutinacija. Pravo vezivanje ne nastaje, eritrociti se jednostavno savijaju u obliku novčića. Ako dodate par kapi fiziološkog rastvora, one se raspadaju. Sličan fenomen se prepoznaje pod mikroskopom.

Hladna aglutinacija krvi. Takva reakcija se opaža ako su uvjeti za istraživanje bili nepovoljni. Kada je temperatura ispod +16 ˚C, može doći do spajanja.

Panaglutinacija. Ako postoji infekcija u krvi, rezultati testa mogu biti lažni. Ova pojava je moguća i u slučaju onkološke bolesti, sa sepsom.

Aglutinacija je veoma važna u medicini. Omogućava ne samo određivanje krvne grupe, već i identifikaciju uzročnika bolesti, kao i prisutnost infekcija. Glavna stvar je slijediti preporuke liječnika prilikom pripreme za ovaj postupak. Što se tiče medicinskog osoblja, njihov zadatak je da stvore povoljne uslove i poštuju sva pravila. Samo na taj način se može postići tačne rezultate prilikom izvođenja aglutinacije krvi.