aglutinācijas fāzes. Lekcija par mikrobioloģiju "Imūnās reakcijas

Aglutinācijas reakcija

Aglutinācija (lat. aglutinācija- līmēšana) - antigēnu saturošu korpuskulāro daļiņu (veselu šūnu, lateksa daļiņu uc) līmēšana (savienošana) ar specifisku antivielu molekulām elektrolītu klātbūtnē, kas beidzas ar pārslu vai nogulumu (aglutināta) veidošanos, kas ir redzama neapbruņotu aci. Nogulumu raksturs ir atkarīgs no antigēna rakstura: flagellas baktērijas dod lielu pārslu nogulsnes, flagellas un bez kapsulas - smalkgraudainas, kapsulāras - stīgas. Atšķirt tiešo aglutināciju, kurā mijiedarbībā ar specifiskām antivielām ir tieši iesaistīti pašu baktēriju vai jebkuras citas šūnas antigēni, piemēram, eritrocīti; un netiešās jeb pasīvās, kurās baktēriju šūnas vai eritrocīti, vai lateksa daļiņas ir ne savas, bet uz tām adsorbētu svešu antigēnu (vai antivielu) nesēji, lai noteiktu tām specifiskās antivielas (vai antigēnus). Aglutinācijas reakcija galvenokārt ietver antivielas, kas pieder IgG un IgM klasēm. Tas notiek divās fāzēs: pirmkārt, notiek specifiska antivielu aktīvā centra mijiedarbība ar antigēna noteicēju, šis posms var notikt, ja nav elektrolītu, un to nepavada redzamas izmaiņas reaģējošā sistēmā. Otrajā posmā, aglutināta veidošanās, ir nepieciešama elektrolītu klātbūtne, kas samazina antigēna + antivielu kompleksu elektrisko lādiņu un paātrina to līmēšanas procesu. Šī fāze beidzas ar aglutināta veidošanos.

Aglutinācijas reakcijas novieto vai nu uz stikla, vai uz gludām kartona plāksnēm, vai sterilās aglutinācijas mēģenēs. Aglutinācijas reakcijas (tiešās un pasīvās) uz stikla parasti tiek izmantotas kā paātrināta metode specifisku antivielu noteikšanai pacienta serumā (piemēram, brucelozes gadījumā) vai patogēna seroloģiskai identificēšanai. Pēdējā gadījumā parasti tiek izmantoti labi attīrīti (adsorbēti) diagnostikas serumi, kas satur tikai monoreceptoru antivielas vai to komplektu pret dažādiem antigēniem. Stikla aglutinācijas reakcijas neapšaubāmā priekšrocība ir tās formulēšanas vienkāršība un fakts, ka tas aizņem vairākas minūtes vai pat sekundes, jo abas sastāvdaļas tajā tiek izmantotas koncentrētā veidā. Tomēr tai ir tikai kvalitatīva vērtība, un tā ir mazāk jutīga nekā mēģene. Paplašināts aglutinācijas tests mēģenēs dod precīzākus rezultātus, jo ļauj noteikt kvantitatīvo antivielu saturu serumā (uzstādīt tā titru) un, ja nepieciešams, reģistrēt antivielu titra palielināšanās faktu, kas ir diagnostisks. vērtību. Lai izveidotu reakciju, aglutinācijā ievada serumu, kas noteiktā veidā atšķaidīts ar 0,85% NaCl šķīdumu, un vienādu tilpumu (parasti 0,5 ml) standarta diagnostikas (vai testa kultūras) suspensijas, kas satur 1 miljardu baktēriju 1 ml. caurules. Aglutinācijas reakcijas rezultātu uzskaite tiek veikta sākotnēji pēc 2 stundu ilgas mēģenes inkubācijas 37 ° C temperatūrā un visbeidzot pēc 20–24 stundām pēc divām pazīmēm: nogulšņu klātbūtne un lielums, kā arī nogulsnēšanās pakāpe. supernatanta caurspīdīgums. Vērtēšana tiek veikta pēc četru krustu sistēmas. Reakciju obligāti papildina seruma un antigēna kontrole. Tajos gadījumos, kad patogēna seroloģiskai identificēšanai izmanto detalizētu aglutinācijas testu mēģenē, tam ir diagnostiska vērtība, ja reakcija novērtēta kā pozitīva, ja diagnostiskais serums ir atšķaidīts ar vismaz pusi no tā titra.

Jāņem vērā, ka, sajaucot homologu antigēnu un antivielu šķīdumus, ne vienmēr tiek novērotas redzamas aglutinācijas reakcijas izpausmes. Nogulsnes veidojas tikai pie noteiktām optimālām abu reakcijas komponentu attiecībām. Ārpus šīm robežām, ja ir ievērojams antigēna vai antivielu pārpalikums, reakcija netiek novērota. Šo parādību sauc par "prozona fenomenu". To novēro gan aglutinācijas reakcijā, gan nokrišņu reakcijā. Prozona parādīšanās imūnreakcijās ir izskaidrojama ar to, ka tajās iesaistītie antigēni parasti ir polideterminanti un molekulas. IgG antivielas ir divi aktīvi centri. Ar antivielu pārpalikumu katras antigēna daļiņas virsma tiek pārklāta ar antivielu molekulām, lai nepaliktu brīvas determinantu grupas, līdz ar to otrs, nesaistītais antivielu aktīvais centrs nevar mijiedarboties ar citu antigēnu daļiņu un saistīt tās viena ar otru. Redzama aglutināta vai nogulšņu veidošanās tiek nomākta arī ar antigēna pārpalikumu, kad nav nevienas brīvas aktīvās antivielu vietas, un līdz ar to antigēns + antiviela + antigēns kompleksus vairs nevar palielināt.

1.1. AGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RA)

AGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RA)

Pateicoties tās specifikai, iestatīšanas vienkāršībai un demonstrativitātei, aglutinācijas reakcija ir kļuvusi plaši izplatīta mikrobioloģiskajā praksē daudzu slimību diagnosticēšanai. infekcijas slimības.

Aglutinācijas reakcijas pamatā ir antivielu (aglutinīnu) mijiedarbības specifika ar veselām mikrobu vai citām šūnām (aglutinogēniem). Šīs mijiedarbības rezultātā veidojas daļiņas - aglomerāti, kas izgulsnējas (aglutinējas) pārslu veidā.

Aglutinācijas reakcijā var piedalīties gan dzīvas, gan mirušas baktērijas, spirohetas, sēnītes, vienšūņi, riketijas, kā arī eritrocīti un citas šūnas. Reakcija norit divās fāzēs: pirmā (neredzamā) specifiskā, antigēna un antivielu savienošanās, otrā (redzamā) nespecifiskā, antigēnu saistīšanās, t.i. aglutināta veidošanās.

Aglutināts veidojas, ja viens divvērtīgās antivielas aktīvs centrs tiek apvienots ar antigēna noteicošo grupu. Aglutinācijas reakcija, tāpat kā jebkura seroloģiskā reakcija, notiek elektrolītu klātbūtnē.

Ārēji pozitīvas aglutinācijas reakcijas izpausme ir divējāda. Mikrobos, kuriem nav karoga un kuriem ir tikai somatiskais O antigēns, pašas mikrobu šūnas tieši salīp kopā. Šādu aglutināciju sauc par smalkgraudainu. Tas notiek 18 22 stundu laikā. v

Karogotajiem mikrobiem ir divi antigēni – somatiskais O antigēns un flagellar H antigēns. Ja šūnas salīp kopā ar flagellas, veidojas lielas irdenas pārslas un šādu aglutinācijas reakciju sauc par rupji graudainu. Tas nāk 24 stundu laikā.

Aglutinācijas reakciju var iestatīt gan specifisku antivielu kvalitatīvai un kvantitatīvai noteikšanai pacienta asins serumā, gan izolētā patogēna sugas noteikšanai. v

Aglutinācijas reakciju var iestatīt gan detalizētā versijā, kas ļauj strādāt ar serumu, kas atšķaidīts līdz diagnostiskajam titram, gan indikatīvās reakcijas iestatīšanas variantā, kas principā ļauj noteikt specifiskas antivielas vai noteikt antivielas. patogēns.

Uzstādot detalizētu aglutinācijas reakciju, lai noteiktu specifiskas antivielas subjekta asins serumā, testa serumu ņem atšķaidījumā 1:50 vai 1:100. Tas ir saistīts ar faktu, ka veselā vai nedaudz atšķaidītā serumā normālas antivielas var būt ļoti augstā koncentrācijā, un tad reakcijas rezultāti var būt neprecīzi. Pārbaudes materiāls šajā reakcijas variantā ir pacienta asinis.

Asinis tiek ņemtas tukšā dūšā vai ne agrāk kā 6 stundas pēc ēšanas (pretējā gadījumā asins serumā var būt tauku pilieni, padarot to duļķainu un pētniecībai nepiemērotu). Pacienta asins serumu parasti iegūst slimības otrajā nedēļā, sterili no kubitālās vēnas savācot 3 4 ml asiņu (līdz šim laikam ir koncentrēts maksimālais specifisko antivielu daudzums). Kā zināms antigēns tiek izmantots diagnostikas līdzeklis, kas sagatavots no konkrētas sugas nogalinātām, bet neiznīcinātām mikrobu šūnām ar specifisku antigēnu struktūru.

Veicot detalizētu aglutinācijas reakciju, lai noteiktu patogēna sugu, veidu, antigēns ir dzīvs patogēns, kas izolēts no testa materiāla. Ir zināmas imūndiagnostikas serumā esošās antivielas. v

Imūndiagnostikas serumu iegūst no vakcinēta truša asinīm. Pēc titra noteikšanas (maksimālais atšķaidījums, kurā tiek noteiktas antivielas), diagnostikas serumu ielej ampulās, pievienojot konservantu. Šo serumu izmanto, lai identificētu pēc izolētā patogēna antigēnās struktūras.

AGLUTINĀCIJAS REAKCIJAS IESPĒJAS

Šajās reakcijās piedalās antigēni daļiņu veidā (mikrobu šūnas, eritrocīti un citi korpuskulārie antigēni), kas salīp kopā ar antivielām un izgulsnējas.

Aglutinācijas reakcijas (RA) izveidošanai ir nepieciešami trīs komponenti: 1) antigēns (aglutinogēns); 2) antiviela (aglutinīns) un 3) elektrolīts (izotonisks nātrija hlorīda šķīdums).

INDIKATĪVĀ (PLĀKSNES) AGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RA)

Aptuvenu jeb lamelāru RA novieto uz stikla priekšmetstikliņa istabas temperatūrā. Lai to izdarītu, ar Pasteur pipeti uz stikla atsevišķi uzpilina seruma pilienu atšķaidījumā 1:10 1:20 un kontroles pilienu. izotonisks šķīdums nātrija hlorīds. Abās bakterioloģiskajās cilpās ievada kolonijas vai ikdienas baktēriju kultūru (diagnostikas pilienu) un rūpīgi sajauc. Reakcijas tiek ņemtas vērā dažu minūšu laikā vizuāli, dažreiz ar palielināmo stiklu (x5). Ar pozitīvu RA pilienā ar serumu tiek novērota lielu un mazu pārslu parādīšanās, ar negatīvu serums paliek vienmērīgi duļķains.

NETIEŠĀS (PASĪVĀS) HEMAGLUTINĀCIJAS REAKCIJA (RNHA, RPHA)

Reakcija tiek iestatīta: 1) noteikt polisaharīdus, proteīnus, baktēriju ekstraktus un citas ļoti izkliedētas vielas, riketsijas un vīrusus, kuru kompleksi ar aglutinīniem parastā RA nav redzami, vai 2) noteikt antivielas šo slimību pacientu serumos. ļoti izkliedētas vielas un mazākie mikroorganismi.

Ar netiešo jeb pasīvo aglutināciju saprot reakciju, kurā antivielas mijiedarbojas ar antigēniem, kas iepriekš adsorbēti uz inertām daļiņām (latekss, celuloze, polistirols, bārija oksīds utt. vai auna eritrocīti, I (0) cilvēka asins grupas).

Pasīvās hemaglutinācijas reakcijā (RPHA) eritrocīti tiek izmantoti kā nesējs. Ar antigēnu noslogotie eritrocīti salīp kopā specifisku antivielu klātbūtnē pret šo antigēnu un izgulsnējas. Antigēnu sensibilizētie eritrocīti tiek izmantoti RPHA kā eritrocītu diagnostikas līdzeklis antivielu noteikšanai (serodiagnostika). Ja eritrocīti ir noslogoti ar antivielām (eritrocītu antivielu diagnostika), tad to var izmantot antigēnu noteikšanai.

Iestudējums. Polistirola tablešu iedobēs sagatavo virkni seruma atšķaidījumu. Priekšpēdējā iedobē pievieno 0,5 ml zināmā pozitīvā seruma un pēdējā iedobē pievieno 0,5 ml sāls šķīduma (kontroles). Pēc tam visām iedobēm pievieno 0,1 ml atšķaidīta eritrocītu diagnostikas, sakrata un ievieto termostatā uz 2 stundām.

Grāmatvedība. Pozitīvā gadījumā eritrocīti nosēžas cauruma apakšā vienmērīga šūnu slāņa veidā ar salocītu vai robainu malu (apgriezts lietussargs), negatīvā gadījumā tie nosēžas pogas vai gredzena veidā. .

1.2. NEITRALIZĀCIJAS REAKCIJA. LYSIS,
OPSONOFAGOCITISKĀ REAKCIJA, PAaugstinātas jutības reakcija

EKSOTOKSĪNA NEITRALIZĀCIJAS REAKCIJA AR ANTITOKSĪNU (RN)

Reakcija balstās uz antitoksiskā seruma spēju neitralizēt eksotoksīna darbību. To izmanto antitoksisko serumu titrēšanai un eksotoksīna noteikšanai.

Titrējot serumu, dažādiem antitoksiskā seruma atšķaidījumiem pievieno noteiktu devu attiecīgā toksīna. Ar pilnīgu antigēna neitralizāciju un neizmantotu antivielu trūkumu notiek sākotnējā flokulācija. Flokulācijas reakciju var izmantot ne tikai seruma titrēšanai (piemēram, difterijai), bet arī toksīna un toksoīda titrēšanai. Toksīnu neitralizācijas reakcijai ar antitoksīnu ir liela praktiska nozīme kā metodei antitoksisku terapeitisko serumu aktivitātes noteikšanai. Šīs reakcijas antigēns ir īsts eksotoksīns.

Antitoksiskā seruma stiprumu nosaka parastās AE mērvienības.

1 AU botulīna seruma tā daudzums neitralizē 1000 DLM botulīna toksīna. Neitralizācijas reakciju, lai noteiktu eksotoksīna sugu vai veidu (stingumkrampju, botulisma, difterijas u.c. diagnostikā), var veikt in vitro (saskaņā ar Ramona teikto), un, nosakot mikrobu šūnu toksicitāti - gēlā ( saskaņā ar Ouchterlony).

Līzes reakcija (RL)

Viena no imūnseruma aizsargājošajām īpašībām ir tā spēja izšķīdināt mikrobus vai šūnu elementus, kas nonāk organismā.

Specifiskas antivielas, kas izraisa šūnu izšķīšanu (līzi), sauc par lizīniem. Atkarībā no antigēna rakstura tie var būt bakteriolizīni, citolizīni, spirohetolizīni, hemolizīni utt.

Lizīni parāda savu iedarbību tikai papildu faktora - komplementa klātbūtnē. Komplements kā nespecifiskas humorālās imunitātes faktors ir atrodams gandrīz visos ķermeņa šķidrumos, izņemot cerebrospinālo šķidrumu un acs priekšējās kameras šķidrumu. Diezgan augsts un nemainīgs komplementa saturs tika konstatēts cilvēka asins serumā un daudz tā jūrascūciņu asins serumā. Citiem zīdītājiem komplementa saturs asins serumā ir atšķirīgs.

Papildinājums ir sarežģīta sistēma sūkalu olbaltumvielas. Tas ir nestabils un sabrūk 55 grādos 30 minūtes. Istabas temperatūrā komplements tiek iznīcināts divu stundu laikā. Tas ir ļoti jutīgs pret ilgstošu kratīšanu, skābju un ultravioleto staru iedarbību. Tomēr komplementu uzglabā ilgu laiku (līdz sešiem mēnešiem) žāvētā stāvoklī zemā temperatūrā. Komplements veicina mikrobu šūnu un eritrocītu līzi.

Izšķir bakteriolīzes un hemolīzes reakciju.

Bakteriolīzes reakcijas būtība ir tāda, ka, kombinējot specifisku imūnserumu ar tam atbilstošajām homologajām dzīvajām mikrobu šūnām komplementa klātbūtnē, mikrobi tiek lizēti.

Hemolīzes reakcija sastāv no tā, ka, eritrocītus pakļaujot specifiskam, tiem imūnam serumam (hemolītiskam) komplementa klātbūtnē, eritrocīti izšķīst, t.i. hemolīze.

Hemolīzes reakciju laboratorijas praksē izmanto, lai noteiktu komplementa tyr, kā arī ņemtu vērā diagnostisko komplementa saistīšanās testu rezultātus. Komplementa titrs ir mazākais daudzums, kas izraisa sarkano asins šūnu līzi 30 minūšu laikā hemolītiskā sistēmā 2,5 ml tilpumā. Līzes reakcija, tāpat kā visas seroloģiskās reakcijas, notiek elektrolīta klātbūtnē.

PAaugstinātas jutības (ALERĢISKAS) REAKCIJAS

Dažas antigēna formas, atkārtoti saskaroties ar ķermeni, var izraisīt reakciju, kas pamatā ir specifiska, bet ietver nespecifiskus akūtas iekaisuma reakcijas šūnu un molekulāros faktorus. Ir zināmas divas hiperreaktivitātes formas: tūlītēja tipa hipersensitivitāte (ITH) un aizkavētā tipa hipersensitivitāte (DTH). Pirmā veida reakcija izpaužas ar antivielu līdzdalību, savukārt reakcija attīstās ne vēlāk kā 2 stundas pēc atkārtotas saskares ar alergēnu. Otrs veids tiek realizēts ar iekaisuma T šūnu (Tr3) palīdzību kā galvenie reakcijas efektori, kas nodrošina makrofāgu uzkrāšanos iekaisuma zonā, reakcija izpaužas pēc 6-8 stundām un vēlāk.

Pirms paaugstinātas jutības reakcijas attīstības notiek tikšanās ar antigēnu un sensibilizācijas rašanās, t.i. antivielu parādīšanās, aktīvi sensibilizēti limfocīti un pasīvi sensibilizēti ar citu leikocītu (makrofāgu, granulocītu) citofīlajām antivielām.

Paaugstinātas jutības reakcijām ir trīs attīstības fāzes: imunoloģiskās; patoķīmisks; patofizioloģiska.

Pirmajā, specifiskajā fāzē alergēns mijiedarbojas ar antivielām un (vai) sensibilizētām šūnām. Otrajā fāzē notiek bioloģiska izdalīšanās aktīvās vielas no aktivizētām šūnām. Atbrīvotie mediatori (histamīns, serotonīns, leikotriēni, bradikinīns u.c.) izraisa dažādus perifēros efektus, kas raksturīgi atbilstošajam reakcijas veidam – trešajai fāzei.

Ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakcijas

Šāda veida reakcijas izraisa sensibilizēto Thelpers, citotoksisko Tlimfocītu (Tkillers) un mononukleāro fagocītu sistēmas aktivēto šūnu patogēna starpšūnu mijiedarbība, ko izraisa ilgstoša imūnsistēmas stimulēšana ar baktēriju antigēniem, kurās ir relatīva organisma imūnsistēmas nepietiekamība. sistēma baktēriju patogēnu izvadīšanai no iekšējās vides infekcijas slimībām. Šīs paaugstinātas jutības reakcijas pacientiem ar tuberkulozi izraisa tuberkulozus plaušu dobumus, to kazeozo nekrozi un vispārēju intoksikāciju. Ādas granulomatozi tuberkulozes un spitālības gadījumā morfopatoģenētiskā ziņā galvenokārt veido ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakcijas.

Slavenākais 4. tipa paaugstinātas jutības reakcijas piemērs ir Mantoux reakcija, kas attīstās intradermālas tuberkulīna ievadīšanas vietā pacientam, kura ķermenis un sistēma ir sensibilizēta pret mikobaktēriju antigēniem. Reakcijas rezultātā veidojas blīva hiperēmiska papula ar nekrozi centrā, kas parādās tikai dažas stundas vēlāk (lēnām) pēc tuberkulīna intradermālas ievadīšanas. Papulas veidošanās sākas ar izeju no asinsvadu gultnes cirkulējošo asiņu mononukleāro fagocītu starpšūnu telpās. Vienlaikus sākas polimorfonukleāro šūnu emigrācija no asinsvadu gultnes. Tad neitrofilo leikocītu infiltrācija samazinās, un infiltrāts sāk sastāvēt galvenokārt no limfocītiem un mononukleāriem fagocītiem. Šī ir atšķirība starp Mantoux reakciju un Artusa reakciju, kurā pārsvarā polimorfonukleāri leikocīti uzkrājas bojājuma vietā.

Ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakcijās ilgstoša sensibilizēto limfocītu stimulēšana ar antigēniem izraisa patoloģiski intensīvu un ilgstošu citokīnu izdalīšanos no T-helperiem patoloģisku izmaiņu vietās audos. Intensīva citokīnu izdalīšanās audu bojājumu lokos izraisa tur esošo mononukleāro fagocītu sistēmas šūnu hiperaktivāciju, no kurām daudzas veido epitēlija šūnu pavedienus hiperaktivētā stāvoklī, un dažas saplūst viena ar otru, veidojot milzu šūnas. Makrofāgi, uz kuru virsmas ir pakļauti baktēriju un vīrusu antigēni, var tikt iznīcināti, izmantojot Tkillers (dabiskos slepkavas).

Ceturtā tipa paaugstinātas jutības reakciju izraisa sveša baktēriju antigēna atpazīšana, ko veic pret to jutīgie T-palīgi. Nepieciešams atpazīšanas nosacījums ir induktoru mijiedarbība ar antigēniem, kas pakļauti antigēnu prezentējošu šūnu virsmai pēc endocitozes un svešu imunogēnu apstrādes ar mononukleāro fagocītu palīdzību. Cits nepieciešamais nosacījums antigēnu iedarbība kombinācijā ar I klases molekulām no galvenā audu saderības kompleksa. Pēc antigēna atpazīšanas sensibilizētie palīgi atbrīvo citokīnus un jo īpaši interleikīnu2, kas aktivizē dabiskos slepkavas un mononukleāros fagocītus. Aktivizētie mononukleārie fagocīti atbrīvo proteolītiskos enzīmus un brīvos skābekļa radikāļus, kas bojā audus.

Ādas alerģisko testu testi, lai noteiktu organisma sensibilizāciju pret alergēniem, lai noteiktu tā infekciju, piemēram, tuberkulozi, brucelozi, ganāmpulka imunitātes līmeni, piemēram, pret tularēmiju. Pēc alergēna ievadīšanas vietas ir: 1) ādas testi; 2) skarifikācija; 3) intradermāli; 4) zemādas. Klīniskā reakcija uz alergēnu ādas alerģiskajā testā ir sadalīta vietējā, vispārējā un fokusa, kā arī tūlītējā un aizkavētā.

HIT mediatora tipa lokālas reakcijas rodas pēc 5-20 minūtēm, izpaužas kā eritēma un tulznas, izzūd pēc dažām stundām, tiek novērtētas ar plusa metodi pēc eritēmas daudzuma, mērot mm. HAT lokālas reakcijas rodas pēc 24–48 stundām, ilgst ilgu laiku, parādās kā infiltrāts, dažkārt ar nekrozi centrā, un tiek novērtētas pēc infiltrāta lieluma mm, arī pēc plus sistēmas. Citotoksiskā un imūnkompleksā GNT tipa gadījumā hiperēmija un infiltrācija tiek novērota pēc 3-4 stundām, maksimumu sasniedz 6-8 stundās un izzūd apmēram pēc dienas. Dažreiz tiek novērotas kombinētas reakcijas.

1.3. PAPILDINĀŠANAS REAKCIJA (CFR)

Šo reakciju izmanto laboratorijas pētījumi antivielu noteikšanai asins serumā dažādu infekciju gadījumā, kā arī patogēna identificēšanai pēc antigēnās struktūras.

Komplementa fiksācijas tests ir sarežģīts seroloģisks tests, un to raksturo augsta jutība un specifiskums.

Šīs reakcijas iezīme ir tāda, ka antigēna izmaiņas tā mijiedarbības laikā ar specifiskām antivielām notiek tikai komplementa klātbūtnē. Komplements tiek adsorbēts tikai uz antivielas-antigēna kompleksa. Antivielu-antigēna komplekss veidojas tikai tad, ja pastāv afinitāte starp antigēnu un serumā esošo antivielu.

Komplementa adsorbcija uz “antigēna antivielu” kompleksa var ietekmēt antigēna likteni dažādos veidos atkarībā no tā īpašībām.

Dažos antigēnos šajos apstākļos notiek asas morfoloģiskas izmaiņas līdz izšķīšanai (hemolīze, Isajeva-Pfeifera fenomens, citolītiska darbība). Citi maina kustības ātrumu (treponēmas imobilizācija). Vēl citi mirst bez asiem destruktīvas izmaiņas(baktericīda vai citotoksiska iedarbība). Visbeidzot, komplementa adsorbcija var nebūt saistīta ar viegli novērojamām izmaiņām antigēnā.

Saskaņā ar mehānismu RSC darbojas divos posmos:

1. Pirmā fāze ir “antigēna antivielu” kompleksa veidošanās un adsorbcija uz šī komplementa kompleksa. Fāzes rezultāts nav vizuāli redzams (antigēna un antivielu mijiedarbība ar obligātu komplementa līdzdalību).
2. Otrā fāze ir antigēna izmaiņas specifisku antivielu ietekmē komplementa klātbūtnē. Fāzes rezultāts var būt vizuāli redzams vai neredzams (reakcijas rezultātu noteikšana, izmantojot indikatoru hemolītisko sistēmu (aitas eritrocītus un hemolītisko serumu).

Eritrocītu iznīcināšana ar hemolītisko serumu notiek tikai komplementa piesaistes gadījumā hemolītiskajai sistēmai. Ja komplements tika adsorbēts agrāk uz antigēna-antivielu kompleksa, tad eritrocītu hemolīze nenotiek.

Eksperimenta rezultātu novērtē, atzīmējot hemolīzes esamību vai neesamību visās mēģenēs. Reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu ar pilnīgu hemolīzes aizkavēšanos, kad mēģenē esošais šķidrums ir bezkrāsains un eritrocīti nosēžas apakšā, negatīva ar pilnīgu eritrocītu līzi, kad šķidrums ir intensīvi krāsots ("lakas" asinis). Hemolīzes aizkavēšanās pakāpi aprēķina atkarībā no šķidruma krāsas intensitātes un eritrocītu nogulumu daudzuma apakšā (++++, +++, ++, +).

Gadījumā, ja antigēna izmaiņas paliek vizuālai novērošanai nepieejamas, ir jāizmanto otra sistēma, kas darbojas kā indikators, kas ļauj novērtēt komplementa stāvokli un izdarīt secinājumu par reakcijas rezultātu.

Šo indikatoru sistēmu attēlo hemolīzes reakcijas komponenti, kas ietver aitu eritrocītus un hemolītisko serumu, kas satur specifiskas antivielas pret eritrocītiem (hemolizīniem), bet nesatur komplementu. Šo indikatoru sistēmu pievieno mēģenēm stundu pēc galvenā CSC iestatīšanas. Ja komplementa saistīšanās reakcija ir pozitīva, tad veidojas antivielu-antigēna komplekss, kas adsorbē komplementu uz sevi. Tā kā komplements tiek izmantots tikai vienai reakcijai nepieciešamajā daudzumā un eritrocītu līze var notikt tikai komplementa klātbūtnē, tad, kad tas tiek adsorbēts uz “antigēna antivielu” kompleksa, eritrocītu līze hemolītiskajā (indikatora) sistēmā nenotiks. . Ja komplementa saistīšanās reakcija ir negatīva, “antigēnu antivielu” komplekss neveidojas, komplements paliek brīvs, un, pievienojot hemolītisko sistēmu, notiek eritrocītu līze.

1.4. DNSPROBES. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR),
ENZĪMU IMŪNĀ METODE (ELISA), FLUORESCENTĀS ANTIVIELU METODE (MFA)

GĒNU ZONDĒŠANAS METODES

Molekulārās bioloģijas intensīvā attīstība un ideālas metodoloģiskās bāzes radīšana gēnu pētījumiem ir kļuvusi par gēnu inženierijas pamatu. Diagnostikas jomā ir radies un strauji attīstās virziens specifisku DNS un RNS nukleotīdu secību noteikšanai, tā sauktajai gēnu zondēšanai. Šādas metodes ir balstītas uz nukleīnskābju spēju hibridizēties, veidojot divpavedienu struktūras komplementāro nukleotīdu (AT, GC) mijiedarbības dēļ.

Lai noteiktu vēlamo DNS (vai RNS) secību, tiek speciāli izveidota tā sauktā polinukleotīdu zonde ar noteiktu bāzes secību. Tās sastāvā ir ieviesta īpaša etiķete, kas ļauj identificēt kompleksa veidošanos.

Lai gan gēnu zondēšanu nevar attiecināt uz imūnķīmiskās analīzes metodēm, tās galvenais princips (komplementāru struktūru mijiedarbība) tiek metodiski realizēts tāpat kā imūndiagnostikas indikatormetodes. Turklāt gēnu zondēšanas metodes ļauj aizpildīt informāciju par infekcijas izraisītāju, ja nav tā fenotipiskās izpausmes (genomā iebūvēti vīrusi, "klusie" gēni).

DNS analīzei paraugs tiek pakļauts denaturācijai, lai iegūtu vienpavedienu struktūras, ar kurām reaģē DNS vai RNS zondes molekulas. Zondu sagatavošanai izmanto vai nu dažādas DNS (vai RNS) sekcijas, kas izolētas no dabiska avota (piemēram, viena vai otra mikroorganisma), kas parasti tiek pasniegtas kā ģenētiskas sekvences kā daļa no vektora plazmīdām, vai ķīmiski sintezēti oligonukleotīdi. Atsevišķos gadījumos kā zonde tiek izmantoti fragmentos hidrolizēti genoma DNS preparāti, dažreiz RNS preparāti, īpaši bieži ribosomu RNS. Kā etiķete tiek izmantoti tie paši indikatori, kā tas ir dažādi veidi imūnķīmiskā analīze: radioaktīvie izotopi, fluoresceīni, biotops (ar turpmāku izpausmi ar avidinenzīma kompleksu) utt.

Analīzes secību nosaka pieejamās zondes īpašības

Pašlaik arvien vairāk tiek izmantoti komerciāli komplekti, kas satur visas nepieciešamās sastāvdaļas.

Vairumā gadījumu analīzes procedūru var iedalīt šādos posmos: parauga sagatavošana (ieskaitot DNS ekstrakciju un denaturāciju), parauga fiksēšana uz nesēja (visbiežāk polimēra membrānas filtra), prehibridizācija, pati hibridizācija, nesaistīto produktu mazgāšana, atklāšana. Ja nav standarta DNS vai RNS zondes preparāta, to vispirms iegūst un marķē.

Paraugu sagatavošanai var būt nepieciešams “audzēt” testa materiālu, lai identificētu atsevišķas baktēriju kolonijas vai palielinātu vīrusu koncentrāciju šūnu kultūrā. Tiek veikta arī tieša asins seruma, urīna, asins šūnu vai visu asiņu paraugu analīze, lai noteiktu infekcijas izraisītāja klātbūtni. Lai atbrīvotu no sastāva nukleīnskābes šūnu struktūras tiek veikta šūnu līze, un dažos gadījumos DNS preparāts tiek attīrīts ar fenolu.

Ārstēšanas laikā ar sārmu notiek DNS denaturācija, t.i., tās pāreja uz vienpavedienu formu. Pēc tam nukleīnskābes paraugu fiksē uz nitrocelulozes vai neilona membrānas nesēja, parasti inkubējot 10 minūtes līdz 4 stundas 80 °C temperatūrā vakuumā. Turklāt prehibridizācijas procesā tiek panākta brīvo saistīšanās vietu inaktivācija, lai samazinātu zondes nespecifisko mijiedarbību ar membrānu. Hibridizācijas process ilgst no 2 līdz 20 stundām atkarībā no DNS koncentrācijas paraugā, izmantotās zondes koncentrācijas un tās lieluma.

Pēc hibridizācijas pabeigšanas un nesaistīto produktu nomazgāšanas tiek atklāts iegūtais komplekss. Ja zonde satur radioaktīvu marķējumu, membrāna tiek pakļauta fotofilmai, lai parādītu reakciju (autoradiogrāfija). Citām etiķetēm izmantojiet atbilstošās procedūras.

Visdaudzsološākā ir neradioaktīvo (tā saukto auksto) zondu ražošana. Uz tā paša pamata tiek izstrādāta hibridizācijas tehnika, kas ļauj noteikt patogēna klātbūtni sekciju preparātos, audu punkcijās, kas ir īpaši svarīgi patomorfoloģiskajā analīzē (in situ hibridizācija).

Būtisks solis gēnu zondēšanas metožu izstrādē bija polimerāzes amplifikācijas reakcijas (PCR) izmantošana. Šī pieeja dod iespēju palielināt konkrētas (iepriekš zināmas) DNS sekvences koncentrāciju paraugā, sintezējot vairākas kopijas in vitro. Lai veiktu reakciju, pievieno DNS polimerāzes enzīmu preparātu, sintēzes dezoksinukleotīdu pārpalikumu un tā sauktos praimerus, divu veidu oligonukleotīdus ar 20-25 bāzēm, kas atbilst interesējošās DNS sekvences gala sekcijām. DNS paraugs tiek pētīts. Vienam no praimeriem ir jābūt kodējošās DNS virknes nolasīšanas apgabala sākuma kopijai 53 nolasīšanas virzienā, bet otrajam jābūt nekodējošās virknes pretējā gala kopijai. Pēc tam ar katru polimerāzes reakcijas ciklu DNS kopiju skaits tiek dubultots.

Praimeru saistīšanai ir nepieciešama DNS denaturācija (kušana) 94 °C temperatūrā, kam seko maisījuma uzsildīšana līdz 4055 °C.

Lai veiktu reakciju, tika izstrādāti programmējami mikroparaugu inkubatori, lai viegli mainītu temperatūras izmaiņas, kas ir optimālas katram reakcijas posmam.

Pastiprināšanas reakcija var ievērojami palielināt analīzes jutīgumu gēnu zondēšanas laikā, kas ir īpaši svarīgi pie zemām infekcijas izraisītāja koncentrācijām.

Viena no nozīmīgajām gēnu zondēšanas ar amplifikāciju priekšrocībām ir iespēja izpētīt submikroskopisku patoloģiskā materiāla daudzumu.

Vēl viena metodes iezīme, kas ir svarīgāka infekciozā materiāla analīzei, ir spēja atklāt slēptos (klusos) gēnus. Metodes, kas saistītas ar gēnu zondēšanas izmantošanu, noteikti tiks plašāk ieviestas infekcijas slimību diagnostikas praksē, jo tās kļūs vienkāršākas un lētākas.

ELISA un RIF metodes lielākoties ir kvalitatīvas vai daļēji kvantitatīvas. Pie ļoti zemām komponentu koncentrācijām antigēna-antivielu kompleksa veidošanos nevar reģistrēt ne vizuāli, ne ar vienkāršiem instrumentāliem līdzekļiem. Antigēna antivielu kompleksa norādīšanu šādos gadījumos var veikt, ja viens no sākotnējiem komponentiem antigēns vai antiviela ievieš marķējumu, ko var viegli noteikt koncentrācijās, kas ir salīdzināmas ar nosakāmās analīta koncentrāciju.

Kā marķējumu var izmantot radioaktīvos izotopus (piemēram, 125I), fluorescējošas vielas un fermentus.

Atkarībā no izmantotās etiķetes ir radioimūnās (RIA), fluorescējošās imūnās (FIA), enzīmu imūnanalīzes (ELISA) analīzes metodes utt. pēdējie gadi plašs praktiska izmantošana saņēma ELISA, kas saistīts ar kvantitatīvu noteikšanu iespēju, augstu jutību, specifiku un uzskaites automatizāciju.

ELISA analīzes metodes ir metožu grupa, kas ļauj noteikt antigēnu antivielu kompleksu, izmantojot substrātu, ko šķeļ ferments ar krāsas izskatu.

Metodes būtība slēpjas antigēna antivielu reakcijas komponentu kombinācijā ar izmērītu enzīma marķējumu. Antigēns vai antiviela, kas reaģē, ir marķēta ar fermentu. Pēc substrāta transformācijas fermenta iedarbībā var spriest par antigēna-antivielu reakcijas komponenta daudzumu, kas nonācis mijiedarbībā. Ferments šajā gadījumā kalpo kā imūnās atbildes marķieris un ļauj to novērot vizuāli vai instrumentāli.

Fermenti ir ļoti ērtas etiķetes, jo to katalītiskās īpašības ļauj tiem darboties kā pastiprinātājiem, jo ​​viena fermenta molekula var radīt vairāk nekā 1 x 105 katalītiskā produkta molekulas minūtē. Ir nepieciešams izvēlēties fermentu, kas ilgstoši saglabā savu katalītisko aktivitāti, nezaudē to, saistoties ar antigēnu vai antivielu, un kuram ir augsta specifika attiecībā pret substrātu.

Galvenās metodes, kā iegūt antivielas vai antigēnus, kas marķēti ar fermentu, konjugātiem: ķīmiskā, imunoloģiskā un gēnu inženierija. Visbiežāk ELISA veikšanai izmanto enzīmus: mārrutku peroksidāzi, sārmaino fosfatāzi, galaktozidāzi u.c.

Lai noteiktu enzīma aktivitāti antigēna-antivielu kompleksā ar mērķi vizuāli un instrumentāli reģistrēt reakciju, tiek izmantoti hromogēnie substrāti, kuru šķīdumi, sākotnēji bezkrāsaini, fermentatīvās reakcijas laikā iegūst krāsu, kuras intensitāte. ir proporcionāls fermenta daudzumam. Tādējādi, lai noteiktu mārrutku peroksidāzes aktivitāti cietās fāzes ELISA testā, kā substrāts tiek izmantota 5aminosalicilskābe, kas dod intensīvi brūnu krāsu, ortofenilēndiamīns, kas veido oranži dzeltenu krāsu. Sārmainās fosfatāzes un?galatozidāzes aktivitātes noteikšanai izmanto attiecīgi nitrofenilfosfātus un nitrofenilgalaktozīdus.

Reakcijas rezultātu, veidojoties krāsainam produktam, nosaka vizuāli vai izmantojot spektrofotometru, kas mēra gaismas absorbciju ar noteiktu viļņa garumu.

Ir daudz iespēju ELISA veikšanai. Ir viendabīgi un neviendabīgi varianti.

Pēc iestatīšanas metodes izšķir konkurējošās un nekonkurējošās ELISA metodes. Ja pirmajā posmā sistēmā atrodas tikai analizētais savienojums un tam atbilstošie saistīšanās centri (antigēns un specifiskās antivielas), tad metode ir nekonkurētspējīga. Ja analizētais savienojums (antigēns) un tā analogs (ar enzīmu iezīmēts antigēns) atrodas pirmajā posmā, konkurējot savā starpā par saistīšanos ar specifiskajiem saistīšanās centriem (antivielām), kas atrodas deficītā, tad metode ir konkurētspējīga. Šajā gadījumā, jo vairāk testa antigēns satur šķīdumu, jo mazāks ir saistīto iezīmēto antigēnu daudzums.

FLUORESCENTĀS ANTIVIELU METODE (MFA) vai IMUNOFLUORSCENCES REAKCIJAS (RIF)

Imunofluorescējošā metode ir izvēles metode nezināma mikroorganisma ātrai noteikšanai un identificēšanai testa materiālā.

Ag + AT + elektrolīts = UV gaismas komplekss

Mikrobu serums, kas marķēts ar fluorohromu

FITC bieži izmanto krāsvielu fluoresceīna izotiocianātu

Šajā pētījumā tiek izmantots fluorescējošais mikroskops.

RIF inscenējums

Uztriepei tiek uzklāts 30 µl FITC iezīmētu antivielu šķīduma.

Novietojiet glāzi mitrā kamerā un inkubējiet istabas temperatūrā 20-25 minūtes vai termostatā 37 ° C temperatūrā 15 minūtes.

Skalojiet glāzi tekošā krāna ūdenī 2 minūtes, noskalojiet ar destilētu ūdeni un nosusiniet gaisā.

Uz izžāvētās uztriepes uzklāj pilienu montāžas šķidruma, uztriepi pārklāj ar pārklājošo stikliņu un mikroskopē, izmantojot fluorescējošu mikroskopu vai fluorescējošu uzgali pie parastā optiskā mikroskopa.

Aglutinācijas reakcija.

Aglutinācijas reakcija ir mikrobu vai citu šūnu (eritrocītu) adhēzija un izgulsnēšanās antivielu iedarbībā elektrolīta klātbūtnē. Redzamais reakcijas efekts (aglutinācijas parādība) ir nogulšņu veidošanās, ko sauc par aglutinātu.

Šo reakciju izmanto serodiagnoze Un seridentifikācija. RA lieto serodiagnostikai (antivielu noteikšanai pacientu asins serumā) vēdertīfs un paratīfs(Vidāla reakcija), bruceloze(Raita reakcija) tularēmija un leptospiroze. RA izmanto seridentifikācijai (nosakot no pacienta izolētā patogēna veidu), kad zarnu infekcijas garais klepus, holēra un utt.

Sastāvdaļasreakcijas:

1. A antigēns (aglutinogēns) - tās ir veselas (nav iznīcinātas) mikrobu vai citas šūnas ( korpuskulārs, nešķīstošs antigēns). Aglutinogēni- tā ir apturēšana dzīvs vai nogalināts mikrobu šūnas vai citas šūnas. Antigēni var būt nezināmi vai zināmi. Nezināms aglutinogēns ir no pacienta ķermeņa izolēta mikrobu kultūra, kas ir jānosaka. zināms antigēns. diagnosticum- diagnostikas zāles - mirušo apturēšana mikrobi zināmas sugas fizioloģiskā šķīdumā. Šī apturēšana miglains (necaurspīdīgs)), jo mikrobu šūnas nešķīst, bet paliek neskartas. Lai noteiktu nezināmas antivielas pacienta serumā, tiks izmantots zināms aglutinogēns.

2. Antivielas (aglutinīns)- atrodams asins serumā. Antivielas var būt arī nezināmas vai zināmas. Asins serumā tiek atrastas nezināmas antivielas, kas jānosaka slims cilvēks. Zināmas antivielas ir atrodamas imūnās diagnostikas serumi, kuras sauc aglutinējošie serumi. Tos izmanto seridentifikācijai, t.i. lai noteiktu nezināmu antigēnu – mikrobu kultūras veidu.

3. Elektrolīts- 0,9% nātrija hlorīda šķīdums.

RA iestatīšanas veidi.

1. Aptuvenais (plates) RA- veikta uz stikla. Uz stikla priekšmetstikliņa uzklājiet 2 pilienus seruma un 1 pilienu izotoniskā šķīduma. Mikrobu kultūru ievada vienā no seruma pilieniem un izotoniskā šķīduma pilē ar cilpu un sajauc. Izotoniskā šķīduma piliens ar mikrobiem – antigēnu kontrole, piliens serumi bez dīgļiem – antivielu kontrole, piliens serums ar mikrobiem – pieredze. Ja serumā ir antivielas, kas atbilst mikrobu antigēniem, kas ir sajaukti ar to, tad antivielas un antigēni specifiski saistīsies viens ar otru un pēc 1-3 minūtēm eksperimentālajā pilē parādīsies aglutināta pārslas. Antigēna kontrolei jābūt duļķainai, un antivielu kontrolei jābūt skaidrai. Reakcijas rezultātu uzskaite tiek veikta, parādoties aglutināta pārslām . Ja pārslas izkrīt, reakcija ir pozitīva, t.i. antigēns atbilst antivielai, un antigēnu var izmantot, lai identificētu antivielu, vai otrādi. Ja duļķainība saglabājas, reakcija ir negatīva.

2. Pagarināta aglutinācijas reakcija - veic mēģenēs. Vispirms no 1:50 līdz 1:1600 sagatavo slima cilvēka asins seruma divkāršus atšķaidījumus. 1 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma ielej 6 mēģenēs. Pirmajā mēģenē pievieno 1 ml pacienta asins seruma atšķaidījumā 1:50, samaisa un iegūst atšķaidījumu 1:100, pēc tam 1 ml atšķaidījuma 1:100 pārnes otrajā mēģenē. un iegūst atšķaidījumu 1:200 utt. Atliek divas mēģenes, lai kontrolētu antigēnu un serumu. Seruma kontrolei pievieno tikai serumu, kas atšķaidīts attiecībā 1:50, antigēna kontrolei pievieno tikai antigēnu. Visām pārējām mēģenēm pievieno 0,1 ml antigēna - diagnosticum (O- vai H-) un visas mēģenes ievieto termostatā 37°C uz 18-20 stundām. Reakcijas rezultātu uzskaite tiek veikta atkarībā no veidošanās veida, nogulšņu (aglutināta) daudzuma un duļķainības pakāpes. Uzskaite tiek veikta tikai ar šādiem rezultātiem kontrolēs: seruma kontrole - caurspīdīga, antigēna kontrole - duļķaina. O-antivielas rada smalki graudainas nogulsnes. H-antivielas - rupji graudaini. Saskaņā ar pēdējo mēģeni, kurā joprojām ir redzama aglutinācijas reakcija, iestatīt diagnostikas titrs.

Veicot slimību serodiagnostiku, ir svarīgi ne tikai noteikt specifiskas antivielas pret konkrētu patogēnu, bet arī noteikt to skaitu, t.i. noteikt šādu antivielu titru, kad mēs varam runāt par slimības klātbūtni, ko izraisa šis patogēns. Šo titru sauc par diagnostikas titru. Piemēram, lai diagnosticētu vēdertīfu, nepieciešams noteikt antivielu titru 1:400, bet ne mazāk. Vēl precīzākus rezultātus iegūst, konstatējot antivielu palielināšanos sapārotajos serumos.Pacienta serumu ņem slimības sākumā un pēc 3-5 un vairāk dienām. Ja antivielu titrs palielinās vismaz 4 reizes, tad mēs varam runāt par pašreizējo slimību.

Mērķis: Apgūt aglutinācijas reakcijas un nokrišņu reakcijas inscenēšanas tehniku ​​infekcijas slimību diagnostikai.

1. modulis Mikroorganismu morfoloģija un fizioloģija. Infekcija. Imunitāte.

16. tēma: Aglutinācijas reakcija. nokrišņu reakcija.

Tēmas atbilstība. Zem imunitāte nozīmē ķermeņa imunitāti pret infekcijas un neinfekcijas izraisītājiem (patogēniem mikroorganismiem, svešām olbaltumvielām un citām vielām). Šos līdzekļus sauc par antigēniem. Imunitāte ir iedzimta vai iegūta. Iedzimta- kad veidojas audu un humorālās aizsargierīces, izraisot imunitāti pret infekcijas slimībām, kas ir iedzimtas.

Iegādāts- to veic organisma imūnsistēma antivielu ražošanas vai sensibilizētu limfocītu uzkrāšanās veidā. Tas ir sadalīts sīkāk dabīgs un mākslīgs. Saskaņā ar darbības mehānismu tas ir sadalīts aktīvs un pasīvs. Visās imunoloģiskās reakcijās galvenā sastāvdaļa ir antigēns.

galvenā funkcija imūnsistēma, kas sastāv no limfoīdiem audiem, ir svešu aģentu (antigēnu) atpazīšana un to neitralizācija.

Antigēni var iekļūt organismā caur Elpceļi, gremošanas traktā, caur ādu un gļotādām. Katrs antigēns stimulē specifisku proteīna vielu – antivielu veidošanos.

Antigēni sadalīts pilnīgos un zemākajos (haptēnos). Pilnīgi antigēni izraisīt pilnīgu imūnreakciju. Bojāti antigēni patstāvīgi neizraisa imūnreakciju, bet dažkārt iegūst šo spēju, konjugējot ar augstas molekulmasas proteīnu nesējiem. Turklāt ir arī antigēni: pushaptēni, proantigēni, heteroantigēni un izoantigēni.

Antivielas ir cilvēka vai dzīvnieka seruma imūnglobulīni. Antivielas veidojas pēc infekcijas, kā arī imunizācijas rezultātā ar novājinātām vai nogalinātām baktērijām, riketsijām, vīrusiem, toksīniem un citiem līdzekļiem. Antivielas- imūnglobulīna proteīni ķīmiskais sastāvs pieder pie glikoproteīniem. Pēc struktūras un imūnbioloģiskajām īpašībām imūnglobulīnus iedala 5 klases: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normālas antivielas sastopams cilvēkiem un dzīvniekiem, kas nav imunizēti. Specifiskas antivielas veidojas infekcijas vai imunizācijas rezultātā.

Reakciju starp antivielu un antigēnu sauc seroloģiskās. Seroloģiskās reakcijas ir ļoti specifiskas un tiek izmantotas daudzu infekcijas slimību diagnostikā. Ir aglutinācijas un nokrišņu reakcijas.

1. Aglutinācijas reakcija (RA) balstās uz antigēna (aglutinogēna) un antivielas (aglutinīna) mijiedarbību, kurā elektrolīta klātbūtnē notiek mikrobu ķermeņu aglutinācija un izgulsnēšanās. Aglutinācijas reakcijas formulējumā ir dažādas modifikācijas.

Augstākā vērtība ir:

- Makroskopiskā (izvietotā) aglutinācija mēģenēs. Pacienta serumam pievieno mikrobu suspensiju (diagnosticum), un pēc 1 stundas termostatā 37 grādu temperatūrā tiek atzīmēts seruma atšķaidījums (titrs), kurā notika reakcija. Aglutinācijas reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu, ja mēģenes apakšā veidojas nogulsnes ar izteiktu supernatanta dzidrināšanu. Šīs nogulsnes sauc par aglutinātu.

Pēc aglutināta rakstura izšķir smalkgraudainu (O) un rupji graudainu (H) aglutināciju. Lai noteiktu smalkgraudainu aglutinātu, tiek izmantots aglutinoskops. Rezultātu uzskaite sākas ar kontroles caurulēm. Pēdējais seruma atšķaidījums, kurā tiek novērota aglutinācija, tiek uzskatīts par tā titru.

Reakcijas mērķis: antivielu noteikšana pacienta serumā.

- mikroskopisks (paātrināts) ) aptuvenā aglutinācija uz stikla. Diagnostiskā imūnseruma pilienam pievieno baktēriju kultūras pilienu un vienmērīgi samaisa. Reakcija notiek istabas temperatūrā pēc 5-10 minūtēm. Pēc tam tiek izveidots konts. Ar pozitīvu reakciju seruma pilē tiek novērota baktēriju uzkrāšanās graudu vai pārslu veidā. Reakcijas mērķis: noteikt patogēna veidu pēc zināma diagnostikas seruma.

- Netiešās (pasīvās) hemaglutinācijas (RNGA) reakcija.Šīs reakcijas būtība slēpjas faktā, ka aunu eritrocīti spēj adsorbēt antigēnus uz to virsmas. Specifisku antivielu ietekmē eritrocīti salīp kopā un izgulsnējas, apakšā veidojot hemaglutinātu. Reakcija ir ļoti jutīga un specifiska. RNGA ļauj noteikt minimālā summa antivielas un bojāti polisaharīdu antigēni. Šo reakciju izmanto daudzu infekcijas slimību diagnostikā (vēdera un tīfs, paratīfs, tuberkuloze utt.).

2. Nokrišņu reakcija (RP ) – antigēna-antivielu kompleksa izgulsnēšanās. Galvenā atšķirība starp RP un RA ir tāda, ka RA gadījumā tiek izmantots korpuskulārais antigēns, savukārt RP antigēns ir proteīna vai polisaharīda rakstura koloidāla viela. Šajā reakcijā antigēnu sauc par precipitinogēnu, un antivielas sauc par precipitīniem. Reakciju ievieto mēģenēs, uzklājot antigēna šķīdumu uz imūnseruma. Ar optimālu antigēna un antivielu attiecību pie robežas

šie šķīdumi veido nogulšņu gredzenu. Ja kā antigēnu izmanto vārītus un filtrētus orgānu un audu ekstraktus, reakciju sauc par termoprecipitācijas reakciju (Ascoli reakcija, kas tiek iekļauta diagnozē Sibīrijas mēris, mēris, tularēmija utt.).

Plaša izmantošana iegūtas izgulsnēšanās reakcijas agarā: vienkārša difūzijas metode, dubultdifūzijas metode.

Nokrišņu veids ir flokulācijas reakcija- lai noteiktu toksoīda vai antitoksiskā seruma aktivitāti. Turklāt šo reakciju var izmantot, lai noteiktu Corynebacterium diphtheriae celmu toksicitāti.

Konkrēti mērķi:

· Izskaidrot antigēnu kā imūnās atbildes inducētāju lomu;

· Aprakstīt antigēnu, tajā skaitā mikroorganismu antigēnu, struktūru;

· Aprakstiet aglutinācijas reakcijas mehānismu;

· Aprakstiet nokrišņu reakcijas mehānismu.

Būt spējīgam:

· Izskaidrot antigēnu kā imūnās atbildes inducētāju lomu;

Aprakstiet antivielu struktūru (dažādas imūnglobulīnu klases);

· Analizēt antivielu mijiedarbības mehānismu ar antigēniem;

· Interpretēt aglutinācijas reakcijas rezultātus;

· Interpretēt nokrišņu reakcijas rezultātus;

· Analizējiet rezultātus.

Teorētiskie jautājumi:

1. Jēdzienu "antigēni", "antivielas" definīcija.

2. Antigēnu kā imūnās atbildes inducētāju loma.

3. Antivielu struktūra (dažādas imūnglobulīnu klases).

4. Antivielu mijiedarbības mehānisms ar antigēniem.

5. Imūnās sistēmas reakcijas, to nozīme imūnreakcijā un infekcijas slimību diagnostikā.

6. Aglutinācijas reakcijas mehānisms.

7. Nokrišņu reakcijas mehānisms.

Praktiskie uzdevumi, kas tiek veikti klasē:

1. Aglutinācijas reakcijas iestatīšana, lai noteiktu antivielas pacienta serumā.

2. Mikroaglutinācijas reakcijas iestatīšana uz stikla ar diagnostikas serumiem, lai identificētu tīru baktēriju kultūru.

3. Aglutinācijas reakcijas rezultātu novērtējums.

4. Nokrišņu reakcijas iestatīšana, lai noteiktu baktēriju antigēnu.

5. Nokrišņu reakcijas rezultātu novērtējums.

6. Netiešās hemaglutinācijas reakcijas rezultātu novērtējums.

7. Protokola reģistrācija.

Literatūra:

1. Pjatkins K.D., Krivošeins Ju.S. Mikrobioloģija ar virusoloģiju un imunoloģiju.- Kijeva: Augstskola, 1992.- 431 lpp.

2. Vorobjovs A.V., Bikovs A.S., Paškovs E.P., Ribakova A.M. Mikrobioloģija.- M.: Medicīna, 1998.- 336s.

3. Medicīniskā mikrobioloģija /Rediģēja V.P. Pokrovskis. - M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotjajevs A.I., Babičevs S.A. Medicīniskā mikrobioloģija, imunoloģija un virusoloģija / Mācību grāmata medicīnas universitātēm, Sanktpēterburga: "Speciālā literatūra", 1998.- 592lpp.

5. Timakovs V.D., Ļevaševs V.S., Borisovs L.B. Mikrobioloģija / Mācību grāmata - 2. izdevums, pārskatīts. un pievienot - M .: Medicīna, 1983.- 512s.

6. Lekciju konspekti.

Papildliteratūra:

1. Titovs M.V. infekcijas slimības.- K., 1995.- 321lpp.

2. Šuvalova E.P. Infekcijas slimības. - M .: Medicīna, 1990. - 559s.

Asins aglutinācija ir sarkano asins šūnu, baktēriju un citu šūnu, kas pārnēsā antigēnus, aglutinācija un sedimentācija.

Process notiek aglutinīnu ietekmē, kas ir specifiskas vielas. Šo vielu loma ir lektīniem vai antivielām.

Iespējamie aglutinācijas veidi asinsgrupas noteikšanā

Aglutinācija ir specifiska un nespecifiska. Pirmajā gadījumā reakcija notiek, piedaloties trim komponentiem:

• antigēni;
• antivielas;
• elektrolīti (izmanto izotonisku šķīdumu).

Asins grupas noteikšanā tiek izmantoti visi iespējamie aglutinācijas veidi, taču tas nav vienīgais gadījums.

Kādam nolūkam to izmanto?

Asins aglutinācijas testu izmanto, lai identificētu infekcijas slimības izraisītāju. Tajā pašā laikā tas nosēžas, un to ir viegli noteikt nogulumos. Šis process tiek izmantots, kā minēts iepriekš, un tas tiks apspriests tālāk.

Kādas ir funkcijas?

Sarkanās asins šūnas satur A un B tipa antigēnus.Tie saistās attiecīgi ar ά un β antivielām. Asins grupas un aglutinācijas reakcijas:

• 1, 0 (ά, β) - uz eritrocītu virsmas nav antigēnu;
• 2, A (β) - ir antigēns A un antiviela β;
• 3, B (ά) - satur antigēnu B un antivielu ά;
• 4, AB (00) - ir divi antigēni, nav antivielu.

Ir vērts atzīmēt, ka antigēni jau ir novēroti embrijā. Runājot par antivielām, tās parādās pēc dzimšanas, pirmajā dzīves mēnesī.

Cilvēku saderība ir atkarīga no asins grupas. Tas ir iemesls, kāpēc mātes ķermenis atgrūž augli. Citiem vārdiem sakot, viņai ir antivielas pret nedzimušā bērna asins antigēniem. Šajā gadījumā rodas nesaderība. Turklāt, veicot pārliešanu, jāņem vērā asinsgrupa.

Sagatavošana

Asins grupas un aglutinācijas reakcijas ir saderīgi jēdzieni, ko bieži izmanto medicīnā.

Pirms pārbaudes ir svarīgi ievērot noteiktus norādījumus. Ir nepieciešams uz laiku izslēgt noteiktu produktu lietošanu un zāles. Tas palīdzēs padarīt rezultātus precīzākus. Ieteikumus, kas jāievēro, nosaka ārsts. Fakts ir tāds, ka dažādās laboratorijās var nebūt vienādi iegūto vērtību diapazoni, tas ir, tie nedaudz atšķiras.

Pārbaudes nosacījumi

Lai asinsgrupa tiktu noteikta precīzi, ir svarīgi izvēlēties pareizo aprīkojumu. Tie ietver:

• un pipete;
• stikla stieņi;
• standarta izohemaglutinējošie serumi;
• sausās māla plāksnes, kas sadalītas 4 sektoros.

Pārbaudes nosacījumiem ir prasības:

• dienasgaisma;
• temperatūra telpā ir virs +16 ˚С;
• asins un seruma tilpumu izmantošana attiecībā 1:10;
• Uzticami rezultāti tiek iegūti 5 minūšu laikā.

Iepriekš minēti galvenie nosacījumi un instrumenti. Asins aglutināciju var veikt vairākos veidos, un katrs no tiem izvirza individuālas prasības.

Metodes

Iespējamās metodes asins grupas noteikšanai, izmantojot aglutināciju:

• standarta metode;
• krusteniskā reakcija;
• tsoliklonu lietošana;
• ekspresmetode, izmantojot komplektu "Erythrotest-Groupcard".

Standarta metode

Asins aglutinācija izpaužas, izmantojot pacienta sarkanās asins šūnas. Tiek izmantoti arī standarta serumi, kas satur zināmus antigēnus.

Uz plakanas plāksnes uzliek 1 pilienu no četriem serumiem. Pēc tam, izmantojot stikla stieņus, tajā ievada izmeklējamā pacienta asinis. Šajā gadījumā ir ērti izmantot acu pilienus. Attiecībai jābūt 1:10. Serums un asinis tiek viegli sajaukti. Piecu minūšu laikā jūs varat novērtēt.

Testa rezultātu atšifrēšana vienkāršā veidā

Pēc noteiktā laika seruma pilienos tiek novērota apgaismība. Dažos var redzēt, ka ir notikusi eritrocītu aglutinācija (mazas pārslas), citās tās nav.

Ir šādas iespējas:

• nav reakcijas visos seruma paraugos - 1. grupa;
• koagulācija notika visur, izņemot 2 paraugus - 2. grupa;
• nav reakcijas tikai 3. paraugā - 3. grupā;
• aglutinācija notika visur - 4. grupa.

Tādējādi galvenais ir pareizi sadalīt serumu. Tad rezultātu atšifrēt nebūs grūti. Ja asins aglutinācija ir vāja, ieteicams veikt atkārtotu pārbaudi. Mazu pārslu gadījumā tās izmeklē mikroskopā.

krusteniskā reakcija

Dažkārt vienkāršā veidā nav iespējams precīzi noteikt asinsgrupu. Aglutinācija šajā gadījumā tiek veikta, izmantojot krusteniskās reakcijas metodi. Atšķirībā no testa pirmās versijas, šeit svarīgi ir standarta eritrocīti. Pacienta asinis tiek ievilktas mēģenē, centrifugētas, un pēc tam serums tiek izsūknēts ar pipeti tālākai izpētei.

To liek uz šķīvja 2 pilienu daudzumā, tad pievieno standarta A un B grupas sarkanās asins šūnas.Saturu maisa, kratot trauku.

Krustreakcijas metodes rezultāti

Pēc piecām minūtēm paraugi ir gatavi pārskatīšanai. Iespējas ir:

• saistīšanās notika abos pilienos - 1 grupa;
• pārslas nav novērotas nevienā no paraugiem - 4. grupa;
• process ir redzams vienā paraugā - 2 vai 3 grupās (atkarībā no tā, kur tieši asinis sarecējušas).

Zoliklona metode

Lai noteiktu asins grupu, aglutināciju šādā veidā veic, izmantojot sintētiskos seruma aizstājējus. Tos sauc par tsolikloniem. Tie satur mākslīgus ά un β-aglutīnu aizstājējus, kas pazīstami kā eritrotesti (attiecīgi rozā un zilā krāsā). Reakcija notiek starp tām un pacienta sarkanajām asins šūnām.

Šī metode ir visprecīzākā un uzticamākā. Būtībā tam nav nepieciešama atkārtota pārbaude. Rezultātu novērtēšana tiek veikta tāpat kā standarta metodes gadījumā. Īpatnība ir tāda, ka tas obligāti jāapstiprina ar reakciju ar konkrētu sintētisko aizstājēju (anti-AB). Turklāt, pievienojot nātrija hlorīda šķīdumu, tajā netiek novērota salipšana.

Ekspress metode ar "Erythrotest-Groupcards" komplektu

Ņemot vērā iespējamās analīzes metodes asinsgrupas noteikšanā, ir vērts atzīmēt, ka šai metodei ir savas īpašības. Tie slēpjas tajā, ka rezultātu var novērtēt ne tikai laboratorijā, bet arī laukā. Pētījumam tiek izmantots īpašs komplekts. Tajā ir iekļauta iedobes karte ar žāvētiem reaģentiem, kas jau atrodas apakšā. Lai noteiktu Rh faktoru, papildus anti-AB, anti-A un anti-B izmanto anti-D.

Šai metodei nav nepieciešama īpaša sagatavošana, ir atļauts izmantot asinis, kas ņemtas no pirksta, konservantu klātbūtne tajās ir pieļaujama. Vispirms katrā iedobē jāpievieno piliens ūdens, lai sastāvdaļas izšķīdinātu. Pēc tam pievieno asinis, nedaudz maisot. Pēc trim minūtēm rezultāts tiks saņemts.

Viltus aglutinācija

Dažreiz dati, kas iegūti pēc pārbaudes, nav patiesi. Šī parādība ir atkarīga no noteiktiem faktoriem.

Ir trīs viltus pozitīvu rezultātu veidi:

Pseidoaglutinācija. Patiesa saistīšanās nenotiek, eritrocīti vienkārši salokās monētu kolonnu veidā. Ja pievieno pāris pilienus fizioloģiskā šķīduma, tie sadalās. Līdzīga parādība tiek atpazīta mikroskopā.

Asins aukstā aglutinācija. Šāda reakcija tiek novērota, ja pētījuma apstākļi bija nelabvēlīgi. Ja temperatūra ir zemāka par +16 ˚C, var rasties saistīšanās.

Panaglutinācija. Ja asinīs ir infekcija, testa rezultāti var būt nepatiesi. Šī parādība ir iespējama arī gadījumā onkoloģiskās slimības, ar sepsi.

Medicīnā ļoti svarīga ir aglutinācija. Tas ļauj ne tikai noteikt asins grupu, bet arī identificēt slimību izraisītāju, kā arī infekciju klātbūtni. Galvenais ir ievērot ārsta ieteikumus, gatavojoties šai procedūrai. Runājot par medicīnas personālu, viņu uzdevums ir radīt labvēlīgus apstākļus un ievērot visus noteikumus. Tikai šādā veidā cilvēks var sasniegt precīzus rezultātus veicot asins aglutināciju.