fáze aglutinace. Přednáška z mikrobiologie „Imunitní reakce

Aglutinační reakce

Aglutinace (lat. aglutinace- lepení) - lepení (spojování) korpuskulárních částic nesoucích antigen (celé buňky, latexové částice atd.) s molekulami specifických protilátek za přítomnosti elektrolytů, které končí tvorbou vloček nebo sedimentu (aglutinátu) viditelných pro pouhé oko. Povaha sedimentu závisí na povaze antigenu: bičíkové bakterie dávají sediment velkých vloček, bičíkový a bezpouzdrový - jemnozrnný, kapsulární - vláknitý. Rozlišujte přímou aglutinaci, ve které se interakce se specifickými protilátkami přímo účastní vlastní antigeny bakteriální nebo jakékoli jiné buňky, jako jsou erytrocyty; a nepřímé nebo pasivní, ve kterých bakteriální buňky nebo erytrocyty nebo latexové částice nejsou vlastními nosiči, ale cizími antigeny (nebo protilátkami), které jsou na nich adsorbovány, aby detekovaly protilátky (nebo antigeny) pro ně specifické. Aglutinační reakce se týká především protilátek třídy IgG a IgM. Probíhá ve dvou fázích: zaprvé dochází ke specifické interakci aktivního centra protilátek s determinantou antigenu, toto stadium může nastat za nepřítomnosti elektrolytů a není provázeno viditelnými změnami v reagujícím systému. Druhý stupeň, tvorba aglutinátu, vyžaduje přítomnost elektrolytů, které snižují elektrický náboj komplexů antigen + protilátka a urychlují proces jejich lepení. Tato fáze končí tvorbou aglutinátu.

Aglutinační reakce jsou umístěny buď na skle nebo na hladkých lepenkových deskách, případně ve sterilních aglutinačních zkumavkách. Aglutinační reakce (přímé i pasivní) na skle se obvykle používají jako zrychlená metoda k průkazu specifických protilátek v séru pacienta (např. u brucelózy) nebo k sérologické identifikaci patogenu. V druhém případě se obvykle používají dobře purifikovaná (adsorbovaná) diagnostická séra obsahující pouze monoreceptorové protilátky nebo jejich sadu na různé antigeny. Nespornou výhodou aglutinační reakce na skle je jednoduchost její formulace a to, že trvá několik minut nebo dokonce sekund, protože obě složky jsou v ní použity v koncentrované formě. Má však pouze kvalitativní hodnotu a je méně citlivý než zkumavka. Rozšířený aglutinační test ve zkumavkách poskytuje přesnější výsledky, protože umožňuje stanovit kvantitativní obsah protilátek v séru (nastavit jeho titr) a v případě potřeby zaregistrovat skutečnost zvýšení titru protilátek, což je diagnostické hodnota. Pro nastavení reakce se do aglutinace zavede sérum naředěné určitým způsobem 0,85% roztokem NaCl a stejný objem (obvykle 0,5 ml) suspenze standardního diagnostika (nebo testovací kultury) obsahující 1 miliardu bakterií v 1 ml. trubky. Zaúčtování výsledků aglutinační reakce se provádí předběžně po 2 hodinách inkubace zkumavek při teplotě 37 ° C a nakonec po 20-24 hodinách podle dvou znaků: přítomnost a velikost sraženiny a stupeň průhlednost supernatantu. Hodnocení se provádí systémem čtyř křížů. Reakce je nutně doprovázena kontrolou séra a antigenu. V těch případech, kdy je k sérologické identifikaci patogena použit podrobný aglutinační test ve zkumavce, má diagnostickou hodnotu, pokud je reakce hodnocena jako pozitivní při naředění diagnostického séra alespoň na polovinu jeho titru.

Je třeba vzít v úvahu, že při míchání roztoků homologních antigenů a protilátek nejsou vždy pozorovány viditelné projevy aglutinační reakce. Sraženina vzniká pouze při určitých optimálních poměrech obou reakčních složek. Mimo tyto limity není při významném přebytku antigenu nebo protilátek pozorována žádná reakce. Tento jev se nazývá „prozónový fenomén“. Je pozorován jak při aglutinační reakci, tak při srážecí reakci. Výskyt prozónu v imunitních reakcích se vysvětluje skutečností, že antigeny, které se na nich podílejí, jsou zpravidla polydeterminantní a molekuly IgG protilátky mají dvě aktivní centra. Při přebytku protilátek se povrch každé částice antigenu pokryje molekulami protilátky, takže nezůstanou žádné volné determinantní skupiny, takže druhé, nenavázané aktivní centrum protilátek nemůže interagovat s jinou antigenní částicí a vázat je na sebe. Tvorba viditelného aglutinátu nebo precipitátu je potlačena i nadbytkem antigenu, kdy není jediné volné aktivní místo protilátek, a proto již nelze zvětšovat komplexy antigen + protilátka + antigen.

1.1. AGLUTINAČNÍ REAKCE (RA)

AGLUTINAČNÍ REAKCE (RA)

Díky své specifičnosti, snadnému nastavení a demonstrativnosti se aglutinační reakce rozšířila v mikrobiologické praxi pro diagnostiku mnoha infekční choroby.

Aglutinační reakce je založena na specifičnosti interakce protilátek (aglutininů) s celými mikrobiálními nebo jinými buňkami (aglutinogeny). V důsledku této interakce vznikají částice – aglomeráty, které se srážejí (aglutinují) ve formě vloček.

Na aglutinační reakci se mohou podílet živé i mrtvé bakterie, spirochety, houby, prvoci, rickettsie, ale i erytrocyty a další buňky. Reakce probíhá ve dvou fázích: první (neviditelná) specifická, spojení antigenu a protilátek, druhá (viditelná) nespecifická, vazba antigenů, tzn. tvorba aglutinátu.

Aglutinát se tvoří, když je jedno aktivní centrum bivalentní protilátky kombinováno s determinantní skupinou antigenu. Aglutinační reakce, jako každá sérologická reakce, probíhá v přítomnosti elektrolytů.

Zevně je projev pozitivní aglutinační reakce dvojí. U nebičíkových mikrobů, které mají pouze somatický O antigen, se samotné mikrobiální buňky drží přímo pohromadě. Taková aglutinace se nazývá jemnozrnná. Probíhá do 18 22 hodin. proti

Bičíkaté mikroby mají dva antigeny somatický O antigen a bičíkový H antigen. Pokud se buňky slepí bičíky, tvoří se velké volné vločky a takové aglutinační reakci se říká hrubozrnná. Dorazí do 2 4 hodin.

Aglutinační reakci lze nastavit jak pro účely kvalitativního a kvantitativního stanovení specifických protilátek v krevním séru pacienta, tak pro účely stanovení druhu izolovaného patogena. proti

Aglutinační reakci lze nastavit jak v podrobné verzi, která umožňuje práci se sérem naředěným na diagnostický titr, tak ve variantě nastavení indikativní reakce, která umožňuje v zásadě detekovat specifické protilátky nebo určit druh patogen.

Při nastavení podrobné aglutinační reakce se za účelem zjištění specifických protilátek v krevním séru subjektu odebere testovací sérum v ředění 1:50 nebo 1:100. To je způsobeno skutečností, že v celém nebo mírně naředěném séru mohou být normální protilátky přítomny ve velmi vysokých koncentracích a výsledky reakce pak mohou být nepřesné. Testovacím materiálem v této variantě reakce je krev pacienta.

Krev se odebírá nalačno nebo ne dříve než 6 hodin po jídle (jinak mohou být v krevním séru kapky tuku, což by mohlo být zakalené a nevhodné pro výzkum). Krevní sérum pacienta se obvykle získává ve druhém týdnu onemocnění, přičemž se z kubitální žíly odebere sterilně 3 4 ml krve (do této doby se koncentruje maximum specifických protilátek). Jako známý antigen se používá diagnostický prostředek připravený z usmrcených, ale nezničených mikrobiálních buněk specifického druhu se specifickou antigenní strukturou.

Při nastavení podrobné aglutinační reakce za účelem stanovení druhu, typu patogenu je antigenem živý patogen izolovaný z testovaného materiálu. Známé jsou protilátky obsažené v imunitním diagnostickém séru. proti

Imunitní diagnostické sérum se získává z krve očkovaného králíka. Po stanovení titru (maximálního ředění, ve kterém jsou protilátky detekovány) se diagnostické sérum nalije do ampulí s přídavkem konzervantu. Toto sérum se používá k identifikaci podle antigenní struktury izolovaného patogenu.

MOŽNOSTI REAKCE AGLUTINACE

Na těchto reakcích se podílejí antigeny ve formě částic (mikrobiální buňky, erytrocyty a další korpuskulární antigeny), které se slepí s protilátkami a vysrážejí se.

Pro nastavení aglutinační reakce (RA) jsou nutné tři složky: 1) antigen (aglutinogen); 2) protilátka (aglutinin) a 3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).

ORIENTAČNÍ (TALÍŘSKÁ) AGLUTINAČNÍ REAKCE (RA)

Přibližná nebo lamelární RA se umístí na podložní sklíčko při pokojové teplotě. K tomu se na sklenici nanese odděleně Pasteurovou pipetou kapka séra v ředění 1:10 1:20 a kontrolní kapka. izotonický roztok chlorid sodný. Do obou bakteriologických smyček se zavedou kolonie nebo denní kultura bakterií (kapka diagnostica) a důkladně se promíchá. Reakce jsou zohledněny během několika minut vizuálně, někdy pomocí lupy (x5). Při pozitivní RA v kapce se sérem je zaznamenán výskyt velkých a malých vloček, při negativním zůstává sérum rovnoměrně zakalené.

REAKCE NEPŘÍMÉ (PASIVNÍ) HEMAGLUTINACE (RNHA, RPHA)

Reakce je nastavena: 1) na detekci polysacharidů, proteinů, extraktů bakterií a dalších vysoce dispergovaných látek, rickettsií a virů, jejichž komplexy s aglutininy nelze u běžné RA vidět, nebo 2) na detekci protilátek v séru pacientů proti těmto vysoce rozptýlené látky a nejmenší mikroorganismy.

Nepřímou neboli pasivní aglutinací se rozumí reakce, při které protilátky interagují s antigeny dříve adsorbovanými na inertních částicích (latex, celulóza, polystyren, oxid barnatý aj. nebo beraní erytrocyty, I (0) lidské krevní skupiny).

Při pasivní hemaglutinační reakci (RPHA) se jako nosič používají erytrocyty. Antigenem nabité erytrocyty se slepí v přítomnosti specifických protilátek proti tomuto antigenu a vysrážejí se. Antigenem senzibilizované erytrocyty se v RPHA používají jako erytrocytární diagnosticum pro průkaz protilátek (serodiagnostika). Pokud jsou erytrocyty zatíženy protilátkami (erythrocyte protilátka diagnosticum), pak může být použit k detekci antigenů.

Inscenace. V jamkách polystyrenových tablet připravte sérii sériových ředění séra. Do předposlední jamky se přidá 0,5 ml známého pozitivního séra a do poslední jamky se přidá 0,5 ml fyziologického roztoku (kontroly). Poté se do všech jamek přidá 0,1 ml zředěného erytrocytárního diagnostica, protřepe se a umístí na 2 hodiny do termostatu.

Účetnictví. V pozitivním případě se erytrocyty usazují na dně jamky ve formě rovnoměrné vrstvy buněk se složeným nebo zubatým okrajem (obrácený deštník), v negativním případě se usazují ve formě knoflíku nebo kroužku. .

1.2. NEUTRALIZAČNÍ REAKCE. LYSIS,
OPSONOFAGOCYTICKÁ REAKCE, REAKCE PŘECENITELNOSTI

EXOTOXINOVÁ NEUTRALIZACE REAKCE S ANTITOXINEM (RN)

Reakce je založena na schopnosti antitoxického séra neutralizovat působení exotoxinu. Používá se pro titraci antitoxických sér a stanovení exotoxinu.

Při titraci séra se k různým ředěním antitoxického séra přidá určitá dávka odpovídajícího toxinu. Při úplné neutralizaci antigenu a nepřítomnosti nepoužitých protilátek dochází k počáteční flokulaci. Vločkovací reakci lze využít nejen pro titraci séra (např. záškrtu), ale také pro titraci toxinu a toxoidu. Reakce neutralizace toxinu s antitoxinem má velký praktický význam jako metoda stanovení aktivity antitoxických terapeutických sér. Antigen v této reakci je skutečný exotoxin.

Síla antitoxického séra je určena konvenčními jednotkami AE.

1 AU botulotoxinu jeho množství neutralizuje 1000 DLM botulotoxinu. Neutralizační reakci k určení druhu nebo typu exotoxinu (při diagnostice tetanu, botulismu, záškrtu atd.) lze provést in vitro (podle Ramona) a při stanovení toxigenity mikrobiálních buněk - v gelu ( podle Ouchterlonyho).

Lytická reakce (RL)

Jednou z ochranných vlastností imunitního séra je jeho schopnost rozpouštět mikroby nebo buněčné prvky, které vstupují do těla.

Specifické protilátky, které způsobují rozpouštění (lýzu) buněk, se nazývají lysiny. V závislosti na povaze antigenu to mohou být bakteriolyziny, cytolysiny, spirochetoliziny, hemolyziny atd.

Lysiny projevují svůj účinek pouze v přítomnosti dalšího faktoru - komplementu. Komplement jako faktor nespecifické humorální imunity se nachází téměř ve všech tělesných tekutinách, kromě mozkomíšního moku a tekutiny přední komory oka. Poměrně vysoký a konstantní obsah komplementu byl zaznamenán v lidském krevním séru a hodně v krevním séru morčat. U jiných savců je obsah komplementu v krevním séru odlišný.

Doplněk je komplexní systém syrovátkové bílkoviny. Je nestabilní a kolabuje při 55 stupních po dobu 30 minut. Při pokojové teplotě je komplement zničen během dvou hodin. Je velmi citlivý na dlouhodobé třesení, na působení kyselin a ultrafialových paprsků. Komplement se však dlouhodobě (až šest měsíců) skladuje v sušeném stavu při nízké teplotě. Komplement podporuje lýzu mikrobiálních buněk a erytrocytů.

Rozlište reakci bakteriolýzy a hemolýzy.

Podstatou reakce bakteriolýzy je, že když je specifické imunitní sérum kombinováno s odpovídajícími homologními živými mikrobiálními buňkami v přítomnosti komplementu, dochází k lýze mikrobů.

Hemolytická reakce spočívá v tom, že při vystavení erytrocytů specifickému, vůči nim imunnímu séru (hemolytickému) za přítomnosti komplementu dochází k rozpuštění erytrocytů, tzn. hemolýza.

Hemolytická reakce se v laboratorní praxi využívá ke stanovení tyru komplementu a také k zohlednění výsledků diagnostických testů fixace komplementu. Titr komplementu je nejmenší množství, které způsobí lýzu červených krvinek během 30 minut v hemolytickém systému v objemu 2,5 ml. Lyzační reakce, stejně jako všechny sérologické reakce, probíhá v přítomnosti elektrolytu.

PŘECITLIVĚLÉ (ALERGICKÉ) REAKCE

Některé formy antigenu mohou při opakovaném kontaktu s tělem vyvolat reakci, která je v zásadě specifická, ale zahrnuje nespecifické buněčné a molekulární faktory akutní zánětlivé reakce. Jsou známy dvě formy hyperreaktivity: hypersenzitivita okamžitého typu (ITH) a hypersenzitivita opožděného typu (DTH). První typ reakce se projevuje za účasti protilátek, přičemž reakce se vyvíjí nejpozději do 2 hodin po opakovaném kontaktu s alergenem. Druhý typ je realizován pomocí zánětlivých T buněk (Tr3) jako hlavních efektorů reakce, které zajišťují akumulaci makrofágů v zóně zánětu, reakce se projevuje po 6-8 hodinách a později.

Vzniku hypersenzitivní reakce předchází setkání s antigenem a vznik senzibilizace, tzn. výskyt protilátek, aktivně senzibilizovaných lymfocytů a pasivně senzibilizovaných cytofilními protilátkami jiných leukocytů (makrofágy, granulocyty).

Hypersenzitivní reakce mají tři fáze vývoje: imunologické; patochemické; patofyziologické.

V první, specifické fázi, alergen interaguje s protilátkami a (nebo) senzibilizovanými buňkami. Ve druhé fázi dochází k uvolnění biologicky účinné látky z aktivovaných buněk. Uvolněné mediátory (histamin, serotonin, leukotrieny, bradykinin aj.) způsobují různé periferní efekty charakteristické pro odpovídající typ reakce – třetí fázi.

Hypersenzitivní reakce čtvrtého typu

Reakce tohoto typu jsou způsobeny patogenními mezibuněčnými interakcemi senzibilizovaných Thelperů, cytotoxických Tlymfocytů (Tkillerů) a aktivovaných buněk systému mononukleárních fagocytů způsobených prodlouženou stimulací imunitního systému bakteriálními antigeny, u kterých dochází k relativní nedostatečnosti imunitního systému organismu. systém k eliminaci bakteriálních patogenů z vnitřního prostředí infekčních onemocnění. Tyto hypersenzitivní reakce způsobují u pacientů s tuberkulózou tuberkulózní plicní dutiny, jejich kaseózní nekrózu a celkovou intoxikaci. Kožní granulomatóza u tuberkulózy a lepry z morfopatogenetického hlediska je z velké části složena z hypersenzitivních reakcí čtvrtého typu.

Nejznámějším příkladem hypersenzitivní reakce typu 4 je Mantouxova reakce, která se rozvine v místě intradermálního podání tuberkulinu pacientovi, jehož tělo a systém jsou senzibilizovány na mykobakteriální antigeny. V důsledku reakce se vytvoří hustá hyperemická papule s nekrózou ve středu, která se objeví až o několik hodin později (pomalu) po intradermálním podání tuberkulinu. Tvorba papule začíná výstupem z cévního řečiště do mezibuněčných prostor mononukleárních fagocytů cirkulující krve. Současně začíná emigrace z cévního řečiště polymorfonukleárních buněk. Poté infiltrace neutrofilů ustoupí a infiltrát se začne skládat převážně z lymfocytů a mononukleárních fagocytů. To je rozdíl mezi Mantouxovou reakcí a Arthusovou reakcí, při které se v místě léze hromadí převážně polymorfonukleární leukocyty.

U hypersenzitivních reakcí čtvrtého typu vede dlouhodobá stimulace senzibilizovaných lymfocytů antigeny k patologicky intenzivnímu a prodlouženému uvolňování cytokinů T-pomocníky v místech patologických změn tkání. Intenzivní uvolňování cytokinů v lokusech tkáňového poškození způsobuje hyperaktivaci buněk systému mononukleárních fagocytů tam umístěných, z nichž mnohé tvoří vlákna epiteloidních buněk v hyperaktivovaném stavu a některé se vzájemně spojují a vytvářejí obří buňky. Makrofágy, na jejichž povrchu jsou vystaveny bakteriální a virové antigeny, mohou být zničeny prostřednictvím fungování Tkillerů (přirozených zabijáků).

Hypersenzitivní reakce čtvrtého typu je vyvolána rozpoznáním cizorodého bakteriálního antigenu T-helpery senzibilizovanými vůči němu. Nezbytnou podmínkou pro rozpoznání je interakce induktorů s antigeny exponovanými na povrchu buněk prezentujících antigen po endocytóze a zpracování cizorodých imunogenů mononukleárními fagocyty. Další nutná podmínka expozice antigenů v kombinaci s molekulami I. třídy z hlavního komplexu tkáňové kompatibility. Senzitizovaní pomocníci po rozpoznání antigenu uvolňují cytokiny a zejména interleukin2, který aktivuje přirozené zabijáky a mononukleární fagocyty. Aktivované mononukleární fagocyty uvolňují proteolytické enzymy a volné kyslíkové radikály, které poškozují tkáně.

Skinalergické testy testy ke zjištění senzibilizace organismu na alergeny, k určení jeho infekce, např. tuberkulózy, brucelózy, úrovně imunity stáda, např. k tularémii. Podle místa zavedení alergenu se rozlišují: 1) kožní testy; 2) vertikutace; 3) intradermální; 4) podkožní. Klinická reakce na alergen v kožním alergickém testu se dělí na lokální, celkovou a fokální, stejně jako okamžitou a opožděnou.

Lokální reakce mediátorového typu HIT se objevují po 5-20 minutách, jsou vyjádřeny jako erytém a puchýře, vymizí po několika hodinách, jsou odhadnuty metodou plus podle množství erytému, měřeno v mm. Lokální reakce HRT se objevují po 24–48 hodinách, trvají dlouho, projevují se jako infiltrát, někdy s nekrózou v centru a hodnotí se podle velikosti infiltrátu v mm, také systémem plus. U cytotoxických a imunokomplexních typů GNT jsou hyperémie a infiltrace pozorovány po 3-4 hodinách, maxima dosahují po 6-8 hodinách a odeznívají asi po dni. Někdy jsou pozorovány kombinované reakce.

1.3. REAKCE PŘIPOJENÍ DOPLNĚK (CFR)

Tato reakce se používá pro laboratorní výzkum pro detekci protilátek v krevním séru při různých infekcích, stejně jako pro identifikaci patogenu podle antigenní struktury.

Komplement fixační test je komplexní sérologický test a vyznačuje se vysokou senzitivitou a specificitou.

Charakteristickým rysem této reakce je, že ke změně antigenu během jeho interakce se specifickými protilátkami dochází pouze v přítomnosti komplementu. Komplement je adsorbován pouze na komplexu protilátka-antigen. Komplex protilátka-antigen se tvoří pouze v případě, že existuje afinita mezi antigenem a protilátkou přítomnou v séru.

Adsorpce komplementu na komplex „antigenové protilátky“ může ovlivnit osud antigenu různými způsoby v závislosti na jeho vlastnostech.

Některé z antigenů za těchto podmínek procházejí prudkými morfologickými změnami až po rozpuštění (hemolýza, Isaev-Pfeiferův fenomén, cytolytické působení). Jiní mění rychlost pohybu (imobilizace treponému). Ještě jiní umírají bez ostrých destruktivní změny(baktericidní nebo cytotoxický účinek). Konečně, adsorpce komplementu nemusí být doprovázena změnami v antigenu, které jsou snadno pozorovatelné.

Podle mechanismu RSC probíhá ve dvou fázích:

První fází je tvorba komplexu „antigenové protilátky“ a adsorpce na tento komplementový komplex. Výsledek fáze není vizuálně viditelný (interakce antigenu a protilátek za povinné účasti komplementu).
Druhou fází je změna antigenu pod vlivem specifických protilátek za přítomnosti komplementu. Výsledek fáze může být vizuálně viditelný nebo neviditelný (detekce výsledků reakce pomocí indikátorového hemolytického systému (ovčí erytrocyty a hemolytické sérum).

K destrukci erytrocytů hemolytickým sérem dochází pouze v případě připojení komplementu k hemolytickému systému. Pokud byl komplement adsorbován dříve na komplex antigen-protilátka, pak nedochází k hemolýze erytrocytů.

Výsledek experimentu se vyhodnotí zaznamenáním přítomnosti nebo nepřítomnosti hemolýzy ve všech zkumavkách. Reakce je považována za pozitivní při úplném zpoždění hemolýzy, kdy je kapalina ve zkumavce bezbarvá a erytrocyty se usazují na dně, negativní při úplné lýze erytrocytů, kdy je kapalina intenzivně zbarvena ("lak" krev). Stupeň zpoždění hemolýzy se odhaduje v závislosti na intenzitě barvy kapaliny a množství sedimentu erytrocytů na dně (++++, +++, ++, +).

V případě, že změny v antigenu zůstávají nepřístupné pro vizuální pozorování, je nutné použít druhý systém, který funguje jako indikátor, který umožňuje posoudit stav komplementu a vyvodit závěr o výsledku reakce.

Tento indikátorový systém představují složky hemolytické reakce, která zahrnuje ovčí erytrocyty a hemolytické sérum obsahující specifické protilátky proti erytrocytům (hemolyziny), ale neobsahující komplement. Tento indikátorový systém se přidá do zkumavek hodinu po nastavení hlavního CSC. Pokud je reakce fixace komplementu pozitivní, pak se vytvoří komplex protilátka-antigen, který na sebe adsorbuje komplement. Vzhledem k tomu, že komplement je použit v množství nezbytném pouze pro jednu reakci a lýza erytrocytů může nastat pouze v přítomnosti komplementu, pak, když je adsorbován na komplex „antigenové protilátky“, nedojde k lýze erytrocytů v hemolytickém (indikátorovém) systému. . Pokud je reakce fixace komplementu negativní, komplex „antigenová protilátka“ se nevytváří, komplement zůstává volný a po přidání hemolytického systému dochází k lýze erytrocytů.

1.4. DNAPROBES. POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR),
ENZYMOVÁ IMUNITNÍ METODA (ELISA), FLUORESCENČNÍ PROTILÁTKOVÁ METODA (MFA)

METODY GENOVÉHO ZKOUŠENÍ

Intenzivní rozvoj molekulární biologie a vytvoření dokonalé metodologické základny pro genetický výzkum se staly základem genetického inženýrství. V oblasti diagnostiky vznikl a rychle se rozvíjí směr pro stanovení specifických nukleotidových sekvencí DNA a RNA, tzv. genové sondování. Takové metody jsou založeny na schopnosti nukleových kyselin hybridizovat za vzniku dvouvláknových struktur díky interakci komplementárních nukleotidů (AT, GC).

Pro stanovení požadované sekvence DNA (neboli RNA) je speciálně vytvořena tzv. polynukleotidová sonda se specifickou sekvencí bází. Do jeho složení je zavedena speciální značka, která umožňuje identifikovat tvorbu komplexu.

Přestože genové sondování nelze přiřadit k metodám imunochemické analýzy, jeho hlavní princip (interakce komplementárních struktur) je metodicky implementován stejně jako indikátorové metody imunodiagnostiky. Metody genového sondování navíc umožňují vyplnit informace o infekčním agens při absenci jeho fenotypové exprese (viry zabudované v genomu, „tiché“ geny).

Pro analýzu DNA je vzorek podroben denaturaci za účelem získání jednořetězcových struktur, se kterými reagují molekuly DNA nebo RNAprobe. Pro přípravu sond se používají buď různé úseky DNA (nebo RNA) izolované z přirozeného zdroje (například jednoho či druhého mikroorganismu), obvykle prezentované jako genetické sekvence jako součást vektorových plazmidů, nebo chemicky syntetizované oligonukleotidy. V některých případech se jako sonda používají preparáty genomové DNA hydrolyzované na fragmenty, někdy preparáty RNA, zvláště často ribozomální RNA. Jako štítek se používají stejné indikátory jako v různé typy imunochemická analýza: radioaktivní izotopy, fluoresceiny, biotop (s dalším projevem komplexem avidinenzymu) atd.

Pořadí analýzy je určeno vlastnostmi dostupné sondy

V současné době se stále více používají komerční sady obsahující všechny potřebné přísady.

Ve většině případů lze postup analýzy rozdělit do následujících fází: příprava vzorku (včetně extrakce a denaturace DNA), fixace vzorku na nosič (nejčastěji polymerní membránový filtr), prehybridizace, samotná hybridizace, promytí nenavázaných produktů, detekce. V nepřítomnosti standardního přípravku DNA nebo RNAprobe se nejprve získá a označí.

Pro přípravu vzorku může být nutné „vypěstovat“ testovaný materiál, aby se identifikovaly jednotlivé bakteriální kolonie nebo se zvýšila koncentrace virů v buněčné kultuře. Provádí se také přímá analýza vzorků krevního séra, moči, krvinek nebo plné krve na přítomnost infekčního agens. K uvolnění nukleových kyselin z kompozice buněčné struktury probíhá buněčná lýza a v některých případech je preparát DNA purifikován fenolem.

Při ošetření alkálií dochází k denaturaci DNA, tedy k jejímu přechodu do jednovláknové formy. Vzorek nukleové kyseliny je poté fixován na nitrocelulózovém nebo nylonovém membránovém nosiči, obvykle inkubací po dobu 10 minut až 4 hodin při 80 °C ve vakuu. Dále je v procesu prehybridizace dosaženo inaktivace volných vazebných míst, aby se snížila nespecifická interakce sondy s membránou. Proces hybridizace trvá od 2 do 20 hodin v závislosti na koncentraci DNA ve vzorku, koncentraci použité sondy a její velikosti.

Po dokončení hybridizace a odmytí nenavázaných produktů je detekován výsledný komplex. Pokud sonda obsahuje radioaktivní značku, pak je membrána vystavena fotografickému filmu, aby se reakce projevila (autoradiografie). Pro ostatní štítky použijte příslušné postupy.

Nejperspektivnější je výroba neradioaktivních (tzv. studených) sond. Na stejném základě se vyvíjí hybridizační technika, která umožňuje prokázat přítomnost patogenu v preparátech řezů, tkáňových punkcích, což je důležité zejména v patomorfologické analýze (in situ hybridizace).

Zásadním krokem ve vývoji metod genového sondování bylo použití polymerázové amplifikační reakce (PCR). Tento přístup umožňuje zvýšit koncentraci specifické (dříve známé) sekvence DNA ve vzorku syntézou více kopií in vitro. K provedení reakce se do enzymu DNA polymerázový přípravek, přebytek deoxynukleotidů pro syntézu a tzv. primery, dva typy oligonukleotidů o 20-25 bázích odpovídajících koncovým úsekům požadované sekvence DNA, přidá Studovaný vzorek DNA. Jeden z primerů musí být kopií začátku čtecí oblasti kódujícího řetězce DNA ve směru čtení 53 a druhý musí být kopií opačného konce nekódujícího řetězce. Poté se s každým cyklem polymerázové reakce počet kopií DNA zdvojnásobí.

Pro navázání primerů je nutná denaturace DNA (tání) při 94 °C, následovaná zahřátím směsi na 4055 °C.

K provedení reakce byly navrženy programovatelné inkubátory pro mikrovzorky, které snadno střídají změny teploty, které jsou optimální pro každý stupeň reakce.

Amplifikační reakce může významně zvýšit citlivost analýzy během genového sondování, což je zvláště důležité při nízkých koncentracích infekčního agens.

Jednou z významných výhod genového sondování s amplifikací je možnost studia submikroskopického množství patologického materiálu.

Dalším rysem metody, důležitějším pro analýzu infekčního materiálu, je schopnost detekovat skryté (tiché) geny. Metody související s využitím genového sondování budou jistě šířeji zaváděny do praxe diagnostiky infekčních onemocnění, protože budou jednodušší a levnější.

Metody ELISA a RIF jsou většinou kvalitativní nebo semikvantitativní. Při velmi nízkých koncentracích složek nelze tvorbu komplexu antigen-protilátka registrovat ani vizuálně, ani jednoduchými instrumentálními prostředky. Indikace komplexu antigen protilátka v takových případech může být provedena, pokud jedna z výchozích složek antigen nebo protilátka zavede značku, kterou lze snadno detekovat v koncentracích srovnatelných s koncentrací stanovovaného analytu.

Jako značku lze použít radioaktivní izotopy (například 125I), fluorescenční látky a enzymy.

V závislosti na použitém značení existují metody analýzy radioimunitní (RIA), fluorescenční imunitní (FIA), enzymatická imunoanalýza (ELISA) atd. minulé rokyširoký praktické využití obdržela ELISA, která je spojena s možností kvantitativních stanovení, vysokou citlivostí, specifičností a automatizací účtování.

Analytické metody ELISA skupina metod, které umožňují detekci komplexu antigen protilátka pomocí substrátu, který je štěpen enzymem s výskytem barvy.

Podstata metody spočívá v kombinaci složek reakce antigen protilátky s naměřeným enzymovým značením. Antigen nebo protilátka, která reaguje, je značena enzymem. Podle transformace substrátu působením enzymu lze posoudit množství složky reakce antigen-protilátka, která vstoupila do interakce. Enzym v tomto případě slouží jako marker imunitní reakce a umožňuje ji pozorovat vizuálně nebo instrumentálně.

Enzymy jsou velmi vhodné značky, protože jejich katalytické vlastnosti jim umožňují působit jako zesilovače, protože jedna molekula enzymu může produkovat více než 1 x 105 molekul katalytického produktu za minutu. Je nutné vybrat enzym, který si dlouho zachovává svou katalytickou aktivitu, neztrácí ji při vazbě na antigen nebo protilátku a má vysokou specificitu vůči substrátu.

Hlavní metody získávání protilátek nebo antigenů značených enzymem, konjugáty: chemické, imunologické a genetické inženýrství. K ELISA se nejčastěji používají enzymy: křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, galaktosidáza ad.

K detekci aktivity enzymu v komplexu antigen-protilátka za účelem vizuální a instrumentální registrace reakce se používají chromogenní substráty, jejichž roztoky zpočátku bezbarvé získávají při enzymatické reakci barvu, jejíž intenzita je úměrná množství enzymu. Pro detekci aktivity křenové peroxidázy v ELISA na pevné fázi se tedy jako substrát používá kyselina 5-aminosalicylová, která poskytuje intenzivní hnědé zbarvení, orthofenylendiamin, který tvoří oranžovožluté zbarvení. K detekci aktivity alkalické fosfatázy a βgalatosidázy se používají nitrofenylfosfáty a nitrofenylgalaktosidy.

Výsledek reakce při vzniku barevného produktu se stanovuje vizuálně nebo pomocí spektrofotometru, který měří absorpci světla o určité vlnové délce.

Existuje mnoho možností pro staging ELISA. Existují homogenní a heterogenní varianty.

Podle způsobu nastavení se rozlišují kompetitivní a nekompetitivní metody ELISA. Pokud je v první fázi v systému přítomna pouze analyzovaná sloučenina a její odpovídající vazebná centra (antigen a specifické protilátky), pak je metoda nekompetitivní. Pokud jsou analyzovaná sloučenina (antigen) a její analog (antigen značený enzymem) přítomny v první fázi, které spolu soutěží o vazbu na specifická vazebná centra (protilátky) přítomná v deficitu, pak je metoda kompetitivní. V tomto případě platí, že čím více testovacího antigenu obsahuje roztok, tím menší je množství navázaných značených antigenů.

FLUORESCENČNÍ PROTILÁTKOVÁ METODA (MFA) nebo IMUNOFLUORESCENČNÍ REAKCE (RIF)

Imunofluorescenční metoda je metodou volby pro rychlou detekci a identifikaci neznámého mikroorganismu v testovaném materiálu.

Ag + AT + elektrolyt = UV světelný komplex

Mikrobové sérum označené fluorochromem

Jako barvivo fluorescein isothiokyanát se často používá FITC

V této studii se používá fluorescenční mikroskop.

RIF inscenace

Na nátěr se aplikuje 30 µl roztoku protilátek značených FITC.

Umístěte sklenici do vlhké komory a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 20-25 minut nebo v termostatu při 37 °C po dobu 15 minut.

Sklenici oplachujte pod tekoucí vodou z vodovodu po dobu 2 minut, opláchněte destilovanou vodou a osušte na vzduchu.

Na vysušený nátěr se nanese kapka montážní kapaliny, nátěr se překryje krycím sklíčkem a mikroskopuje se pomocí fluorescenčního mikroskopu nebo fluorescenčního nástavce na klasický optický mikroskop.

Aglutinační reakce.

Aglutinační reakce je adheze a precipitace mikrobiálních nebo jiných buněk (erytrocytů) působením protilátek v přítomnosti elektrolytu. Viditelným efektem reakce (aglutinační fenomén) je tvorba sraženiny, která se nazývá aglutinát.

Tato reakce se používá pro sérodiagnostika A séroidentifikace. RA se používá pro sérodiagnostiku (detekce protilátek v krevním séru pacientů) břišní tyfus a paratyfus(Vidální reakce), brucelóza(Wrightova reakce), tularémie a leptospirózy. RA se používá k séroidentifikaci (určení typu patogenu izolovaného z pacienta), když střevní infekcečerný kašel, cholera atd.

Komponentyreakce:

1. A antigen (aglutinogen) - jedná se o celé (ne zničené) mikrobiální nebo jiné buňky ( korpuskulární, nerozpustný antigen). Aglutinogeny- je to pozastavení naživu nebo zabil mikrobiální buňky nebo jakékoli jiné buňky. Antigeny mohou být neznámé nebo známé. Neznámý aglutinogen je mikrobiální kultura izolovaná z těla pacienta, kterou je třeba stanovit. známý antigen. diagnosticum- diagnostický lék - suspendování mrtvých mikroby známé druhy ve fyziologickém roztoku. Toto pozastavení mlhavý (neprůhledný)), protože mikrobiální buňky se nerozpustí, ale zůstanou neporušené. K detekci neznámých protilátek v séru pacienta bude použit známý aglutinogen.

2. Protilátka (aglutinin)- nachází se v krevním séru. Protilátky mohou být také neznámé nebo známé. Neznámé protilátky, které mají být stanoveny, se nacházejí v krevním séru nemocný člověk. Známé protilátky se nacházejí v imunitní diagnostická séra, které se nazývají aglutinační séra. Používají se k séroidentifikaci, tzn. k určení neznámého antigenu – typu mikrobiální kultury.

3. Elektrolyt- 0,9% roztok chloridu sodného.

Způsoby nastavení RA.

1. Přibližná (deska) RA- provádí se na skle. Na podložní sklíčko naneste 2 kapky séra a 1 kapku izotonického roztoku. Mikrobiální kultura se zavede do jedné z kapek séra a do kapky izotonického roztoku s kličkou a promíchá se. Kapka izotonického roztoku s choroboplodnými zárodky – kontrola antigenu, kapka bezmikrobní séra – kontrola protilátek, kapka sérum s mikroby – Zkušenosti. Pokud sérum obsahuje protilátky odpovídající mikrobiálním antigenům, které jsou s ním smíchány, pak se protilátky a antigeny na sebe specificky navážou a po 1-3 minutách se v experimentální kapce objeví aglutinační vločky. Antigenová kontrola by měla být zakalená a protilátková kontrola by měla být čirá. Výsledky reakce se započítávají podle vzhledu vloček aglutinátu . Pokud vločky vypadnou, je reakce pozitivní, tzn. antigen odpovídá protilátce a antigen může být použit k identifikaci protilátky nebo naopak. Pokud zákal zůstane, je reakce negativní.

2. Rozšířená aglutinační reakce - prováděné ve zkumavkách. Nejprve se připraví 2-násobné ředění krevního séra nemocného člověka od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného se nalije do 6 zkumavek. Do první zkumavky se přidá 1 ml pacientova krevního séra v ředění 1:50, promíchá se a získá se ředění 1:100, poté se přenese 1 ml v ředění 1:100 do druhé zkumavky a získá se ředění 1:200 atd. Pro kontrolu antigenu a séra jsou ponechány dvě zkumavky. Ke kontrole séra se přidává pouze sérum naředěné 1:50, ke kontrole s antigenem se přidává pouze antigen. Do všech ostatních zkumavek se přidá 0,1 ml antigenu - diagnosticum (O- nebo H-) a všechny zkumavky se umístí do termostatu při 37°C na 18-20 hodin. Zaúčtování výsledků reakce se provádí podle povahy, množství vytvořené sraženiny (aglutinátu) a stupně zákalu. Zaúčtování se provádí pouze s následujícími výsledky v kontrolách: kontrola séra - průhledná, kontrola antigenu - zakalená. O-protilátky poskytují jemnozrnnou sraženinu. H-protilátky - hrubozrnné. Podle poslední zkumavky, ve které je ještě vidět aglutinační reakce, nastavte diagnostický titr.

Při sérodiagnostice onemocnění je důležité nejen detekovat specifické protilátky proti konkrétnímu patogenu, ale také identifikovat jejich počet, tzn. stanovit takový titr protilátek, když můžeme mluvit o přítomnosti onemocnění způsobeného tímto patogenem. Tento titr se nazývá diagnostický titr. Například pro diagnostiku břišního tyfu je nutné detekovat titr protilátek 1:400, ale ne méně. Ještě přesnějších výsledků se dosáhne zjištěním nárůstu protilátek v párových sérech.Sérum pacienta se odebírá na počátku onemocnění a po 3-5 a více dnech. Pokud se titr protilátek zvýší alespoň 4krát, pak můžeme mluvit o aktuálním onemocnění.

Cílová: Zvládnout techniku stagingu aglutinační reakce a precipitační reakce pro diagnostiku infekčních onemocnění.

Modul 1 Morfologie a fyziologie mikroorganismů. Infekce. Imunita.

Téma 16: Aglutinační reakce. srážecí reakce.

Relevance tématu. Pod imunita implikují imunitu těla vůči infekčním a neinfekčním agens (patogenní mikroorganismy, cizorodé proteiny a další látky). Tato činidla se nazývají antigeny. Imunita je buď vrozená, nebo získaná. Kongenitální- když se vytvářejí tkáňové a humorální ochranné prostředky, které způsobují imunitu vůči infekčním chorobám, které jsou dědičné.

Získané- probíhá imunitním systémem organismu ve formě tvorby protilátek nebo hromadění senzibilizovaných lymfocytů. Je rozdělena na přírodní a umělé. Podle mechanismu účinku se dělí na aktivní a pasivní. Ve všech imunologických reakcích je hlavní složkou antigen.

hlavní funkce imunitní systém, který se skládá z lymfoidní tkáně, je rozpoznání cizích agens (antigenů) a jejich neutralizace.

Antigeny mohou vstupovat do těla skrz Dýchací cesty, trávicím traktem, přes kůži a sliznice. Každý antigen stimuluje tvorbu specifických bílkovinných látek – protilátek.

Antigeny dělí na úplné a podřadné (hapteny). Kompletní antigeny vyvolat kompletní imunitní odpověď. Defektní antigeny nezpůsobují nezávisle imunitní odpověď, ale někdy tuto schopnost získají, když jsou konjugovány s vysokomolekulárními proteinovými nosiči. Kromě toho existují antigeny: semihapteny, proantigeny, heteroantigeny a izoantigeny.

Protilátky jsou lidské nebo zvířecí sérové imunoglobuliny. Protilátky se tvoří po infekci a v důsledku imunizace oslabenými nebo usmrcenými bakteriemi, rickettsiemi, viry, toxiny a dalšími agens. Protilátky- imunoglobulinové proteiny chemické složení patří mezi glykoproteiny. Podle struktury a imunobiologických vlastností se imunoglobuliny dělí na 5 tříd: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normální protilátky vyskytující se u neimunizovaných lidí a zvířat. Specifické protilátky se tvoří v důsledku infekce nebo imunizace.

Reakce mezi protilátkou a antigenem se nazývá sérologické. Sérologické reakce jsou vysoce specifické a používají se v diagnostice mnoha infekčních onemocnění. Dochází k reakcím aglutinace a precipitace.

1. Aglutinační reakce (RA) je založena na interakci antigenu (aglutinogenu) a protilátky (aglutininu), při které dochází k aglutinaci a precipitaci mikrobiálních tělísek za přítomnosti elektrolytu. Existují různé modifikace formulace aglutinační reakce.

Nejvyšší hodnota mít:

- Makroskopická (nasazená) aglutinace ve zkumavkách. Do pacientova séra se přidá suspenze mikrobů (diagnosticum) a po 1 hodině v termostatu při teplotě 37 stupňů se zaznamená ředění (titr) séra, při kterém k reakci došlo. Aglutinační reakce se považuje za pozitivní, když se na dně zkumavky vytvoří sraženina s výrazným vyčeřením supernatantu. Tato sraženina se nazývá aglutinát.

Podle charakteru aglutinátu se rozlišuje jemnozrnná (O) a hrubozrnná (H) aglutinace. K detekci jemnozrnného aglutinátu se používá aglutinoskop. Účtování výsledků začíná u kontrolních zkumavek. Poslední ředění séra, ve kterém je pozorována aglutinace, se považuje za jeho titr.

Účel reakce: průkaz protilátek v séru pacienta.

- mikroskopický (zrychlený) ) přibližná aglutinace na skle. Kapka bakteriální kultury se přidá ke kapce diagnostického imunitního séra a rovnoměrně se promíchá. Reakce probíhá při teplotě místnosti po 5-10 minutách. Poté je vytvořen účet. Při pozitivní reakci v kapce séra je zaznamenána akumulace bakterií ve formě zrn nebo vloček. Účel reakce: určit typ patogenu podle známého diagnostického séra.

- Reakce nepřímé (pasivní) hemaglutinace (RNGA). Podstata této reakce spočívá v tom, že beraní erytrocyty jsou schopny adsorbovat antigeny na svém povrchu. Pod vlivem specifických protilátek se erytrocyty slepí a vysrážejí, na dně tvoří hemaglutinát. Reakce je vysoce citlivá a specifická. RNGA vám umožňuje detekovat minimální množství protilátky a defektní polysacharidové antigeny. Tato reakce se využívá při diagnostice mnoha infekčních onemocnění (břišní a tyfus paratyfus, tuberkulóza atd.).

2. Srážecí reakce (RP ) – precipitaci komplexu antigen-protilátka. Hlavní rozdíl mezi RP a RA je v tom, že u RA se používá korpuskulární antigen, zatímco u RP je antigenem koloidní látka proteinové nebo polysacharidové povahy. Při této reakci se antigen nazývá precipitinogen a protilátky se nazývají precipitiny. Reakce se vloží do zkumavek navrstvením roztoku antigenu na imunitní sérum. S optimálním poměrem antigenu a protilátek na hranici

tyto roztoky tvoří kruh sraženiny. Pokud se jako antigen použijí vařené a filtrované extrakty orgánů a tkání, nazývá se reakce termoprecipitační reakce (Ascoliho reakce, která je uváděna v diagnóze antrax mor, tularémie atd.).

Široké použití získané srážecí reakce na agaru: jednoduchá difúzní metoda, dvojitá difúzní metoda.

Typ srážek je flokulační reakce- ke stanovení aktivity toxoidu nebo antitoxického séra. Kromě toho lze tuto reakci použít ke stanovení toxigenity kmenů Corynebacterium diphtheriae.

Konkrétní cíle:

· Vysvětlete roli antigenů jako induktorů imunitní odpovědi;

· Popsat strukturu antigenů, včetně antigenů mikroorganismů;

· Popište mechanismus aglutinační reakce;

· Popište mechanismus srážecí reakce.

Být schopný:

· Vysvětlete roli antigenů jako induktorů imunitní odpovědi;

Popište strukturu protilátek (různé třídy imunoglobulinů);

· Analyzovat mechanismus interakce protilátek s antigeny;

· interpretovat výsledky aglutinační reakce;

· interpretovat výsledky srážecí reakce;

· Analyzujte výsledky.

Teoretické otázky:

1. Vymezení pojmu "antigeny", "protilátky".

2. Úloha antigenů jako induktorů imunitní odpovědi.

3. Struktura protilátek (různé třídy imunoglobulinů).

4. Mechanismus interakce protilátek s antigeny.

5. Reakce imunitního systému, jejich role v imunitní odpovědi a diagnostice infekčních onemocnění.

6. Mechanismus aglutinační reakce.

7. Mechanismus srážecí reakce.

Praktické úkoly, které se plní ve třídě:

1. Nastavení aglutinační reakce pro detekci protilátek v séru pacienta.

2. Nastavení mikroaglutinační reakce na skle s diagnostickými séry k identifikaci čisté bakteriální kultury.

3. Vyhodnocení výsledků aglutinační reakce.

4. Nastavení srážecí reakce pro detekci bakteriálního antigenu.

5. Vyhodnocení výsledků srážecí reakce.

6. Vyhodnocení výsledků reakce nepřímé hemaglutinace.

7. Registrace protokolu.

Literatura:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologie s virologií a imunologií - Kyjev: Vyšší škola, 1992.- 431s.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologie.- M.: Medicína, 1998.- 336s.

3. Lékařská mikrobiologie /Edited by V.P. Pokrovskij - M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Lékařská mikrobiologie, imunologie a virologie / Učebnice pro lékařské univerzity, Petrohrad: "Speciální literatura", 1998.- 592s.

5. Timakov V.D., Levašev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologie / Učebnice - 2. vydání, přepracováno. a dodat - M .: Medicína, 1983.- 512s.

6. Poznámky k přednášce.

Doplňková literatura:

1. Titov M.V. infekční choroby.- K., 1995.- 321s.

2. Šuvalová E.P. Infekční nemoci - M .: Medicína, 1990. - 559. léta.

Krevní aglutinace je aglutinace a sedimentace červených krvinek, bakterií a dalších buněk, které nesou antigeny.

Proces probíhá pod vlivem aglutininů, což jsou specifické látky. Úlohou těchto látek jsou lektiny nebo protilátky.

Možné typy aglutinace při určování krevní skupiny

Aglutinace je specifická a nespecifická. V prvním případě se reakce vyskytuje za účasti tří složek:

antigeny;
protilátky;
elektrolyty (používá se izotonický roztok).

Při určování krevní skupiny se používají všechny možné druhy aglutinace, ale není to jediný případ.

K jakému účelu se používá?

Krevní aglutinační test se používá k identifikaci původce infekčního onemocnění. Zároveň se usazuje a v sedimentu je snadné jej odhalit. Tento proces se používá, jak je uvedeno výše, a to je to, co bude dále diskutováno.

Jaké jsou vlastnosti?

Červené krvinky obsahují antigeny typu A a B. Vážou se na ά a β protilátky. Krevní skupiny a aglutinační reakce:

1, 0 (ά, β) - na povrchu erytrocytů nejsou žádné antigeny;
2, A (β) - jsou přítomny antigen A a protilátka β;
3, B (ά) - obsahuje antigen B a protilátku ά;
4, AB (00) - jsou přítomny dva antigeny, chybí protilátky.

Stojí za zmínku, že antigeny jsou pozorovány již v embryu. Co se týče protilátek, ty se objevují po narození, v prvním měsíci života.

Kompatibilita lidí závisí na krevní skupině. To je důvodem odmítnutí plodu tělem matky. Jinými slovy, má protilátky proti krevním antigenům nenarozeného dítěte. V tomto případě dochází k nekompatibilitě. Při transfuzi je navíc nutné vzít v úvahu krevní skupinu.

Příprava

Krevní skupiny a aglutinační reakce jsou kompatibilní pojmy, které se často používají v medicíně.

Před testem je důležité dodržovat určité pokyny. Je nutné dočasně vyloučit používání některých přípravků a léky. To pomůže zpřesnit výsledky. Doporučení, která je třeba dodržovat, předepisuje lékař. Faktem je, že různé laboratoře nemusí mít stejné rozsahy získaných hodnot, to znamená, že se mírně liší.

Podmínky pro zkoušku

Aby byla krevní skupina určena přesně, je důležité zvolit správné vybavení. Tyto zahrnují:

a pipeta;
skleněné tyče;
standardní isohemaglutinační séra;
suché kameninové desky, které jsou rozděleny do 4 sektorů.

Na podmínky zkoušky jsou kladeny požadavky:

denní světlo;
teplota v místnosti je nad +16 ˚С;
použití objemů krve a séra v poměru 1:10;
Spolehlivé výsledky se dostaví do 5 minut.

Výše jsou uvedeny hlavní podmínky a nástroje. Krevní aglutinace může být provedena několika způsoby a každý z nich klade individuální požadavky.

Metody

Možné metody stanovení krevní skupiny pomocí aglutinace:

standardní metoda;
křížová reakce;
použití tsoliklonů;
expresní metodou pomocí sady "Erythrotest-Groupcard".

Standardní metoda

Krevní aglutinace se projevuje pomocí červených krvinek pacienta. Používají se také standardní séra, která obsahují známé antigeny.

Na plochý talíř se umístí 1 kapka čtyř sér. Poté se na ni pomocí skleněných tyčinek zavede vyšetřovaná krev pacienta. V tomto případě je vhodné použít kapátka. Poměr by měl být 1:10. Sérum a krev se jemně promíchají. Do pěti minut můžete hodnotit.

Dešifrování výsledků testů jednoduchým způsobem

Po uplynutí stanovené doby v kapkách séra je pozorováno osvícení. U některých můžete vidět, že došlo k aglutinaci erytrocytů (malé vločky), u jiných chybí.

K dispozici jsou následující možnosti:

ve všech vzorcích séra není žádná reakce - skupina 1;
ke koagulaci došlo všude kromě 2 vzorků - skupina 2;
žádná reakce pouze ve vzorku 3 - skupina 3;
aglutinace se vyskytovala všude - skupina 4.

Hlavní věcí je tedy správné rozložení séra. Pak nebude těžké rozluštit výsledek. Pokud je krevní aglutinace slabá, doporučuje se provést test znovu. V případě malých vloček se zkoumají pod mikroskopem.

křížová reakce

Někdy jednoduchým způsobem není možné přesně určit krevní skupinu. Aglutinace se v tomto případě provádí metodou křížové reakce. Na rozdíl od první verze testu jsou zde důležité standardní erytrocyty. Krev pacienta se odebere do zkumavky, odstředí a poté se sérum odčerpá pipetou pro další výzkum.

Nanese se na misku v množství 2 kapek, poté se k ní přidají standardní červené krvinky skupiny A a B. Obsah se promíchá třepáním nádoby.

Výsledky metody křížové reakce

Po pěti minutách jsou vzorky připraveny ke kontrole. Možnosti jsou:

ke spojení došlo u obou kapek - 1 skupina;
vločky nebyly pozorovány v žádném ze vzorků - skupina 4;
proces je viditelný na jednom vzorku - 2 nebo 3 skupině (podle toho, kde přesně se krev srazila).

Zoliklonová metoda

Pro stanovení krevní skupiny se aglutinace tímto způsobem provádí pomocí syntetických náhražek séra. Říká se jim tsoliklones. Obsahují umělé náhražky ά a β-aglutinů známé jako erythrotesty (růžové a modré). K reakci dochází mezi nimi a červenými krvinkami pacienta.

Tato metoda je nejpřesnější a nejspolehlivější. V zásadě nevyžaduje přezkoušení. Vyhodnocení výsledků se provádí stejným způsobem jako v případě standardní metody. Zvláštností je, že musí být nutně potvrzen reakcí se specifickou syntetickou náhražkou (anti-AB). Navíc není pozorováno žádné lepení, když se přidá roztok chloridu sodného.

Expresní metoda se sadou "Erythrotest-Groupcards"

Vzhledem k možným metodám analýzy při určování krevní skupiny stojí za zmínku, že tato metoda má své vlastní charakteristiky. Spočívají v tom, že výsledek lze vyhodnotit nejen v laboratoři, ale i v terénu. Pro studium se používá speciální sada. Obsahuje kartu jamky se sušenými činidly, která jsou již na dně. Ke stanovení Rh faktoru se kromě anti-AB, anti-A a anti-B používá anti-D.

Tato metoda nevyžaduje speciální přípravu, je povoleno používat krev odebranou z prstu, je v ní povolena přítomnost konzervačních látek. Nejprve musíte do každé jamky přidat kapku vody, aby se přísady rozpustily. Poté se přidá krev za mírného míchání. Za tři minuty se dostaví výsledek.

Falešná aglutinace

Někdy údaje získané po testu nejsou pravdivé. Tento jev závisí na určitých faktorech.

Existují tři typy falešných poplachů:

Pseudoaglutinace. Ke skutečnému navázání nedochází, erytrocyty se jednoduše složí ve formě sloupců mincí. Pokud přidáte pár kapek fyziologického roztoku, rozpadnou se. Podobný jev je rozpoznán pod mikroskopem.

Studená aglutinace krve. Taková reakce je pozorována, pokud byly podmínky pro studii nepříznivé. Pokud je teplota nižší než +16 ˚C, může dojít ke slepení.

Panaglutinace. Pokud je v krvi infekce, výsledky testů mohou být falešné. Tento jev je možný i v případě onkologická onemocnění, se sepsí.

Aglutinace je v medicíně velmi důležitá. Umožňuje nejen určit krevní skupinu, ale také identifikovat původce onemocnění a také přítomnost infekcí. Hlavní věcí je při přípravě na tento postup dodržovat doporučení lékaře. Pokud jde o zdravotnický personál, jeho úkolem je vytvářet příznivé podmínky a dodržovat všechna pravidla. Jen tak lze dosáhnout přesné výsledky při provádění krevní aglutinace.