faze aglutinacije. Predavanje iz mikrobiologije „Imunološke reakcije

Reakcija aglutinacije

Aglutinacija (lat. aglutinacija- lijepljenje) - lijepljenje (spajanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijele stanice, čestice lateksa i sl.) s molekulama specifičnih protutijela u prisutnosti elektrolita, što završava stvaranjem ljuskica ili sedimenta (aglutinata) vidljivih golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelarne bakterije daju sediment velikih pahuljica, flagelarne i bez kapsule - fino zrnate, kapsularne - žilaste. Razlikovati izravnu aglutinaciju, u kojoj interakcija sa specifičnim protutijelima izravno uključuje vlastite antigene bakterijske ili bilo koje druge stanice, poput eritrocita; i neizravne, ili pasivne, u kojima su bakterijske stanice ili eritrociti, ili čestice lateksa nositelji ne svojih vlastitih, već stranih antigena (ili antitijela) adsorbiranih na njih kako bi se otkrila antitijela (ili antigeni) koja su za njih specifična. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje protutijela koja pripadaju klasama IgG i IgM. Protječe u dvije faze: prvo, postoji specifična interakcija aktivnog središta protutijela s determinantom antigena, ova se faza može dogoditi u nedostatku elektrolita i nije popraćena vidljivim promjenama u reakcijskom sustavu. Druga faza, stvaranje aglutinata, zahtijeva prisutnost elektrolita koji smanjuju električni naboj kompleksa antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihova lijepljenja. Ova faza završava stvaranjem aglutinata.

Aglutinacijske reakcije postavljaju se na staklene ili glatke kartonske ploče ili u sterilne aglutinacijske epruvete. Reakcije aglutinacije (izravne i pasivne) na staklu obično se koriste kao ubrzana metoda za otkrivanje specifičnih protutijela u serumu bolesnika (npr. kod bruceloze) ili za serološku identifikaciju uzročnika. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska protutijela ili njihov skup na različite antigene. Nedvojbena prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njezine formulacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, budući da se obje komponente koriste u njoj u koncentriranom obliku. Međutim, on ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Prošireni test aglutinacije u epruvetama daje točnije rezultate, jer vam omogućuje određivanje kvantitativnog sadržaja protutijela u serumu (postavljanje njegovog titra) i, ako je potrebno, registraciju činjenice povećanja titra protutijela, što je dijagnostički. vrijednost. Za postavljanje reakcije u aglutinaciju se unosi serum razrijeđen s 0,85% otopinom NaCl na određeni način i jednaki volumen (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili testne kulture) koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml. cijevi. Računanje rezultata reakcije aglutinacije provodi se preliminarno nakon 2 sata inkubacije epruveta na temperaturi od 37 ° C i konačno nakon 20-24 sata prema dva znaka: prisutnosti i veličini precipitata i stupnju taloga. prozirnost supernatanta. Ocjenjivanje se provodi po sustavu četiri križića. Reakcija je nužno popraćena kontrolom seruma i antigena. U onim slučajevima kada se za serološku identifikaciju uzročnika koristi detaljan test aglutinacije u epruveti, dijagnostičku vrijednost ima ako je reakcija ocijenjena pozitivnom kada je dijagnostički serum razrijeđen s najmanje polovicom svog titra.

Treba uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i protutijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog nastaje samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, sa značajnim viškom antigena ili antitijela, nema reakcije. Taj se fenomen naziva "fenomen prozone". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji taloženja. Pojava prozona u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih u pravilu polideterminantni, a molekule IgG antitijela imaju dva aktivna centra. S viškom protutijela površina svake antigenske čestice prekriva se molekulama protutijela tako da ne ostaju slobodne determinantne skupine, pa drugi, nevezani aktivni centar protutijela ne može djelovati s drugom antigenskom česticom i međusobno ih vezati. Stvaranje vidljivog aglutinata ili precipitata također je potisnuto s viškom antigena, kada nema niti jednog slobodnog aktivnog mjesta protutijela, pa se stoga kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećati.

1.1. REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Zbog svoje specifičnosti, jednostavnosti postavljanja i demonstrativnosti, reakcija aglutinacije postala je raširena u mikrobiološkoj praksi za dijagnostiku mnogih zarazne bolesti.

Reakcija aglutinacije temelji se na specifičnosti međudjelovanja protutijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama (aglutinogeni). Kao rezultat te interakcije nastaju čestice – nakupine koje se talože (aglutiniraju) u obliku ljuskica.

U reakciji aglutinacije mogu sudjelovati i žive i mrtve bakterije, spirohete, gljivice, protozoe, rikecije, kao i eritrociti i druge stanice. Reakcija se odvija u dvije faze: prva (nevidljiva) specifična, veza antigena i antitijela, druga (vidljiva) nespecifična, vezivanje antigena, tj. stvaranje aglutinata.

Aglutinat nastaje kada se jedno aktivno središte dvovalentnog protutijela spoji s determinantnom skupinom antigena. Reakcija aglutinacije, kao i svaka serološka reakcija, odvija se u prisutnosti elektrolita.

Izvana, manifestacija pozitivne reakcije aglutinacije je dvojaka. Kod mikroba bez biča, koji imaju samo somatski O antigen, same mikrobne stanice se izravno lijepe zajedno. Takva se aglutinacija naziva sitnozrnatom. Održava se unutar 18 22 sata. v

Flagelirani mikrobi imaju dva antigena somatski O antigen i flagelarni H antigen. Ako se stanice slijepe bičevima, nastaju velike rahle ljuskice i takva reakcija aglutinacije naziva se grubo zrnata. Dolazi u roku od 2 4 sata.

Reakcija aglutinacije može se postaviti kako u svrhu kvalitativnog i kvantitativnog određivanja specifičnih protutijela u krvnom serumu bolesnika, tako i u svrhu određivanja vrste izoliranog uzročnika. v

Reakcija aglutinacije može se postaviti kako u detaljnoj verziji, koja omogućuje rad sa serumom razrijeđenim na dijagnostički titar, tako iu varijanti postavljanja indikativne reakcije, koja omogućuje, u načelu, otkrivanje specifičnih protutijela ili određivanje vrste uzročnik bolesti.

Pri postavljanju detaljne reakcije aglutinacije, radi otkrivanja specifičnih protutijela u krvnom serumu ispitanika, ispitni serum uzima se u razrjeđenju 1:50 ili 1:100. To je zbog činjenice da u cijelom ili malo razrijeđenom serumu normalna antitijela mogu biti prisutna u vrlo visokim koncentracijama, a tada rezultati reakcije mogu biti netočni. Materijal za ispitivanje u ovoj varijanti reakcije je krv pacijenta.

Krv se uzima na prazan želudac ili ne prije 6 sati nakon obroka (inače, u krvnom serumu mogu biti kapljice masti, što ga čini mutnim i neprikladnim za istraživanje). Krvni serum pacijenta obično se dobiva u drugom tjednu bolesti, prikupljanjem sterilne iz kubitalne vene 3 4 ml krvi (do ovog trenutka koncentrirana je maksimalna količina specifičnih antitijela). Kao poznati antigen koristi se dijagnostikum pripremljen od ubijenih ali neuništenih mikrobnih stanica određene vrste sa specifičnom antigenskom strukturom.

Kod postavljanja detaljne reakcije aglutinacije radi određivanja vrste, vrste uzročnika, antigen je živi uzročnik izoliran iz ispitivanog materijala. Poznata su antitijela sadržana u imunološkom dijagnostičkom serumu. v

Imunološki dijagnostički serum dobiva se iz krvi cijepljenog kunića. Nakon određivanja titra (maksimalnog razrjeđenja u kojem se otkrivaju protutijela), dijagnostički serum se ulijeva u ampule uz dodatak konzervansa. Ovaj serum koristi se za identifikaciju prema antigenskoj strukturi izoliranog uzročnika.

OPCIJE REAKCIJE AGLUTINACIJE

U tim reakcijama sudjeluju antigeni u obliku čestica (stanice mikroba, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni) koji se lijepe s protutijelima i talože.

Za postavljanje reakcije aglutinacije (RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen); 2) antitijelo (aglutinin) i 3) elektrolit (izotonična otopina natrijeva klorida).

POKAZNA (PLOČA) REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Aproksimativni ili lamelarni RA stavlja se na predmetno staklo na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, kap seruma u razrjeđenju 1:10 1:20 i kontrolna kap odvojeno se nanose na staklo s Pasteur pipetom. izotonična otopina natrijev klorid. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unesu se u obje bakteriološke petlje i dobro promiješaju. Reakcije se uzimaju u obzir za nekoliko minuta vizualno, ponekad i povećalom (x5). S pozitivnim RA u kapi sa serumom, bilježi se pojava velikih i malih ljuskica, s negativnim, serum ostaje ravnomjerno mutan.

REAKCIJA NEIZRAVNE (PASIVNE) HEMAGLUTINACIJE (RNHA, RPHA)

Reakcija se postavlja: 1) za otkrivanje polisaharida, proteina, ekstrakata bakterija i drugih visoko dispergiranih tvari, rikecija i virusa, čiji se kompleksi s aglutininima ne mogu vidjeti u običnom RA, ili 2) za otkrivanje protutijela u serumima bolesnika na te visoko dispergirane tvari i najsitniji mikroorganizmi.

Pod neizravnom ili pasivnom aglutinacijom podrazumijeva se reakcija u kojoj protutijela stupaju u interakciju s antigenima prethodno adsorbiranim na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. ili eritrociti ovna, I (0) ljudske krvne grupe).

U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA) kao nosač se koriste eritrociti. Eritrociti opterećeni antigenom lijepe se zajedno u prisutnosti specifičnih protutijela na ovaj antigen i talože se. Antigenom senzibilizirani eritrociti koriste se u RPHA kao eritrocitni dijagnostikum za dokazivanje protutijela (serodijagnostika). Ako su eritrociti opterećeni protutijelima (erythrocyte antibody diagnosticum), tada se njime mogu detektirati antigeni.

Inscenacija. U jažicama polistirenskih tableta pripremite niz serijskih razrjeđenja seruma. U pretposljednju jažicu dodaje se 0,5 ml poznatog pozitivnog seruma, au posljednju jažicu 0,5 ml fiziološke otopine (kontrole). Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razrijeđenog eritrocitnog dijagnostikuma, protrese i stavi u termostat na 2 sata.

Računovodstvo. U pozitivnom slučaju eritrociti se talože na dnu rupice u obliku ravnomjernog sloja stanica s presavijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom slučaju talože se u obliku gumba ili prstena. .

1.2. REAKCIJA NEUTRALIZACIJE. LIZA,
OPSONOFAGOCITNA REAKCIJA, REAKCIJA PREOSJETLJIVOSTI

REAKCIJA NEUTRALIZACIJE EGZOTOKSINA S ANTITOKSINOM (RN)

Reakcija se temelji na sposobnosti antitoksičnog seruma da neutralizira djelovanje egzotoksina. Koristi se za titraciju antitoksičnih seruma i određivanje egzotoksina.

Kada se serum titrira, određena doza odgovarajućeg toksina dodaje se različitim razrjeđenjima antitoksičnog seruma. Uz potpunu neutralizaciju antigena i odsutnost neiskorištenih protutijela dolazi do početne flokulacije. Reakcija flokulacije može se koristiti ne samo za titraciju seruma (na primjer, difterije), već i za titraciju toksina i toksoida. Reakcija neutralizacije toksina antitoksinom od velike je praktične važnosti kao metoda za određivanje aktivnosti antitoksičnih terapijskih seruma. Antigen u ovoj reakciji je pravi egzotoksin.

Jačina antitoksičnog seruma određena je konvencionalnim jedinicama AE.

1 AU botulinum seruma njegova količina neutralizira 1000 DLM botulinum toksina. Reakcija neutralizacije za određivanje vrste ili vrste egzotoksina (u dijagnozi tetanusa, botulizma, difterije itd.) Može se provesti in vitro (prema Ramonu), a pri određivanju toksigenosti mikrobnih stanica - u gelu ( prema Ouchterlonyju).

reakcija lize (RL)

Jedno od zaštitnih svojstava imunološkog seruma je njegova sposobnost da otapa mikrobe ili stanične elemente koji ulaze u tijelo.

Specifična protutijela koja uzrokuju otapanje (lizu) stanica nazivaju se lizini. Ovisno o prirodi antigena, mogu biti bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini itd.

Lizini pokazuju svoj učinak samo u prisutnosti dodatnog faktora - komplementa. Komplement, kao čimbenik nespecifične humoralne imunosti, nalazi se u gotovo svim tjelesnim tekućinama, osim u cerebrospinalnoj tekućini i tekućini prednje očne komore. Prilično visok i stalan sadržaj komplementa zabilježen je u ljudskom krvnom serumu, a dosta u krvnom serumu zamorca. Kod ostalih sisavaca sadržaj komplementa u krvnom serumu je drugačiji.

Komplement je složen sustav proteini sirutke. Nestabilan je i kolabira na 55 stupnjeva 30 minuta. Na sobnoj temperaturi, komplement se uništava unutar dva sata. Vrlo je osjetljiv na dugotrajno mućkanje, na djelovanje kiselina i ultraljubičastih zraka. Međutim, komplement se dugo čuva (do šest mjeseci) u osušenom stanju na niskoj temperaturi. Komplement potiče razgradnju mikrobnih stanica i eritrocita.

Razlikovati reakciju bakteriolize i hemolize.

Bit reakcije bakteriolize je da kada se specifični imunološki serum kombinira s njegovim odgovarajućim homolognim živim mikrobnim stanicama u prisutnosti komplementa, mikrobi se liziraju.

Reakcija hemolize sastoji se u činjenici da kada se eritrociti izlože specifičnom, imunom na njih serumu (hemolitiku) u prisutnosti komplementa, eritrociti se otapaju, tj. hemoliza.

Reakcija hemolize u laboratorijskoj praksi koristi se za određivanje tyr komplementa, kao i za uzimanje u obzir rezultata dijagnostičkih testova vezanja komplementa. Titar komplementa je najmanja količina koja uzrokuje lizu crvenih krvnih stanica unutar 30 minuta u hemolitičkom sustavu u volumenu od 2,5 ml. Reakcija lize, kao i sve serološke reakcije, događa se u prisutnosti elektrolita.

REAKCIJE PREOSJETLJIVOSTI (ALERGIJE).

Određeni oblici antigena mogu pri ponovljenom kontaktu s tijelom izazvati reakciju koja je u osnovi specifična, ali uključuje nespecifične stanične i molekularne čimbenike akutnog upalnog odgovora. Poznata su dva oblika hiperreaktivnosti: preosjetljivost neposrednog tipa (ITH) i preosjetljivost odgođenog tipa (DTH). Prva vrsta reakcije manifestira se uz sudjelovanje protutijela, dok se reakcija razvija najkasnije 2 sata nakon ponovljenog kontakta s alergenom. Drugi tip se provodi uz pomoć upalnih T stanica (Tr3) kao glavnih efektora reakcije, koje osiguravaju nakupljanje makrofaga u zoni upale, reakcija se manifestira nakon 6-8 sati i kasnije.

Razvoju reakcije preosjetljivosti prethodi susret s antigenom i pojava senzibilizacije, tj. pojava antitijela, aktivno senzibiliziranih limfocita i pasivno senzibiliziranih citofilnim antitijelima drugih leukocita (makrofagi, granulociti).

Reakcije preosjetljivosti imaju tri faze razvoja: imunološku; patokemijski; patofiziološki.

U prvoj, specifičnoj fazi, alergen stupa u interakciju s protutijelima i/ili senzibiliziranim stanicama. U drugoj fazi dolazi do oslobađanja bioloških djelatne tvari iz aktiviranih stanica. Oslobođeni medijatori (histamin, serotonin, leukotrieni, bradikinin itd.) uzrokuju različite periferne učinke karakteristične za odgovarajući tip reakcije - treća faza.

Reakcije preosjetljivosti četvrtog tipa

Reakcije ovog tipa uzrokovane su patogenim međustaničnim interakcijama senzibiliziranih Thelpera, citotoksičnih Tlimfocita (Tkillera) i aktiviranih stanica mononuklearnog fagocitnog sustava uzrokovanih dugotrajnom stimulacijom imunološkog sustava bakterijskim antigenima, u kojima postoji relativna insuficijencija imunološkog sustava organizma. sustav za uklanjanje bakterijskih uzročnika iz unutarnjeg okoliša zarazne bolesti. Ove reakcije preosjetljivosti uzrokuju tuberkulozne plućne šupljine, njihovu kazeoznu nekrozu i opću intoksikaciju u tuberkuloznih bolesnika. Granulomatoza kože kod tuberkuloze i lepre u morfopatogenetskom smislu velikim je dijelom sastavljena od reakcija preosjetljivosti četvrtog tipa.

Najpoznatiji primjer reakcije preosjetljivosti tipa 4 je Mantouxova reakcija, koja se razvija na mjestu intradermalne primjene tuberkulina kod bolesnika čije su tijelo i sustav senzibilizirani na mikobakterijske antigene. Kao rezultat reakcije nastaje gusta hiperemična papula s nekrozom u središtu, koja se pojavljuje tek nekoliko sati kasnije (polako) nakon intradermalne primjene tuberkulina. Stvaranje papule počinje izlaskom iz vaskularnog kreveta u međustanične prostore mononuklearnih fagocita cirkulirajuće krvi. Istodobno počinje emigracija polimorfonuklearnih stanica iz vaskularnog sloja. Zatim neutrofilna infiltracija jenjava, a infiltrat se počinje sastojati pretežno od limfocita i mononuklearnih fagocita. To je razlika između Mantouxove reakcije i Arthusove reakcije, u kojoj se pretežno polimorfonuklearni leukociti nakupljaju na mjestu lezije.

U reakcijama preosjetljivosti četvrtog tipa, dugotrajna stimulacija senzibiliziranih limfocita antigenima dovodi do patološki intenzivnog i produljenog oslobađanja citokina T-helpera na mjestima patoloških promjena u tkivima. Intenzivno oslobađanje citokina u mjestima oštećenja tkiva uzrokuje hiperaktivaciju stanica sustava mononuklearnih fagocita koji se tamo nalaze, od kojih mnoge tvore niti epiteloidnih stanica u hiperaktiviranom stanju, a neke se međusobno spajaju u divovske stanice. Makrofagi, na čijoj su površini izloženi bakterijski i virusni antigeni, mogu se uništiti djelovanjem Tkillera (prirodnih ubojica).

Reakcija preosjetljivosti četvrtog tipa izazvana je prepoznavanjem stranog bakterijskog antigena od strane T-helpera senzibiliziranih prema njemu. Nužan uvjet za prepoznavanje je interakcija induktora s antigenima izloženim na površini stanica koje prezentiraju antigen nakon endocitoze i obrade stranih imunogena mononuklearnim fagocitima. Još nužan uvjet izloženost antigenima u kombinaciji s molekulama klase I iz glavnog kompleksa tkivne kompatibilnosti. Nakon prepoznavanja antigena, senzibilizirani pomagači otpuštaju citokine, a posebno interleukin2, koji aktivira prirodne ubojice i mononuklearne fagocite. Aktivirani mononuklearni fagociti otpuštaju proteolitičke enzime i slobodne kisikove radikale koji oštećuju tkiva.

Kožnoalergijski testovi testovi za utvrđivanje osjetljivosti tijela na alergene, za određivanje njegove infekcije, na primjer, tuberkuloza, bruceloza, razina imuniteta stada, na primjer, na tularemiju. Prema mjestu unošenja alergena razlikuju se: 1) kožni testovi; 2) scarification; 3) intradermalni; 4) potkožni. Klinička reakcija na alergen u kožno-alergijskom testu dijeli se na lokalnu, opću i žarišnu, trenutnu i odgođenu.

Lokalne reakcije medijatorskog tipa HIT-a javljaju se nakon 5-20 minuta, izražavaju se kao eritem i mjehurić, nestaju nakon nekoliko sati, procjenjuju se plus metodom količinom eritema, mjereno u mm. Lokalne reakcije HNL-a javljaju se nakon 24-48 sati, traju dugo, pojavljuju se kao infiltrat, ponekad s nekrozom u središtu, a procjenjuju se veličinom infiltrata u mm, također plus sustavom. Kod citotoksičnih i imunokompleksnih tipova GNT, hiperemija i infiltracija se uočavaju nakon 3-4 sata, postižu maksimum nakon 6-8 sati i nestaju nakon otprilike jednog dana. Ponekad se promatraju kombinirane reakcije.

1.3. REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (CFR)

Ova reakcija se koristi za laboratorijska istraživanja za otkrivanje antitijela u krvnom serumu kod raznih infekcija, kao i za identifikaciju uzročnika antigenskom strukturom.

Test vezanja komplementa složen je serološki test i karakterizira ga visoka osjetljivost i specifičnost.

Značajka ove reakcije je da se promjena antigena tijekom njegove interakcije sa specifičnim antitijelima događa samo u prisutnosti komplementa. Komplement se adsorbira samo na kompleksu antitijelo-antigen. Kompleks antitijelo-antigen nastaje samo ako postoji afinitet između antigena i antitijela prisutnog u serumu.

Adsorpcija komplementa na kompleksu "antigensko protutijelo" može utjecati na sudbinu antigena na različite načine, ovisno o njegovim karakteristikama.

Neki od antigena pod tim uvjetima prolaze kroz oštre morfološke promjene, sve do otapanja (hemoliza, Isaev-Pfeiferov fenomen, citolitičko djelovanje). Drugi mijenjaju brzinu kretanja (imobilizacija treponema). Drugi pak umiru bez oštrice destruktivne promjene(baktericidno ili citotoksično djelovanje). Konačno, adsorpcija komplementa ne mora biti popraćena promjenama u antigenu koje su lako vidljive.

Prema mehanizmu, RSC se odvija u dvije faze:

1. Prva faza je stvaranje kompleksa "antigen protutijelo" i adsorpcija na ovom kompleksu komplementa. Rezultat faze nije vizualno vidljiv (interakcija antigena i protutijela uz obvezno sudjelovanje komplementa).
2. Druga faza je promjena antigena pod utjecajem specifičnih protutijela u prisutnosti komplementa. Rezultat faze može biti vizualno vidljiv ili nevidljiv (detekcija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sustava (ovčji eritrociti i hemolitički serum).

Uništavanje eritrocita hemolitičkim serumom događa se samo u slučaju vezanja komplementa na hemolitički sustav. Ako je komplement ranije adsorbiran na kompleks antigen-antitijelo, tada ne dolazi do hemolize eritrocita.

Rezultat pokusa procjenjuje se bilježenjem prisutnosti ili odsutnosti hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom s potpunim odgodom hemolize, kada je tekućina u epruveti bezbojna, a eritrociti se talože na dno, negativnom s potpunom lizom eritrocita, kada je tekućina intenzivno obojena ("lak" krv). Stupanj kašnjenja hemolize procjenjuje se ovisno o intenzitetu boje tekućine i količini sedimenta eritrocita na dnu (++++, +++, ++, +).

U slučaju kada promjene u antigenu ostaju nedostupne za vizualno promatranje, potrebno je koristiti drugi sustav koji djeluje kao indikator koji vam omogućuje da procijenite stanje komplementa i donesete zaključak o rezultatu reakcije.

Ovaj indikatorski sustav predstavljaju komponente reakcije hemolize, koja uključuje ovčje eritrocite i hemolitički serum koji sadrži specifična protutijela na eritrocite (hemolizine), ali ne sadrži komplement. Ovaj sustav indikatora dodaje se u epruvete jedan sat nakon postavljanja glavnog CSC-a. Ako je reakcija fiksacije komplementa pozitivna, tada nastaje kompleks antitijelo-antigen koji adsorbira komplement na sebe. Budući da se komplement koristi u količini potrebnoj za samo jednu reakciju, a liza eritrocita može se dogoditi samo u prisutnosti komplementa, tada kada se on adsorbira na kompleksu "antigen protutijela", neće doći do lize eritrocita u hemolitičkom (indikatorskom) sustavu. . Ako je reakcija fiksacije komplementa negativna, kompleks “antigen protutijelo” ne nastaje, komplement ostaje slobodan, a pri dodavanju hemolitičkog sustava dolazi do lize eritrocita.

1.4. DNAPROBE. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR),
ENZIMSKA IMUNOLOŠKA METODA (ELISA), FLUORESCENTNA ANTITIJELA METODA (MFA)

METODE ISPITIVANJA GENA

Intenzivan razvoj molekularne biologije i stvaranje savršene metodološke osnove za genetička istraživanja postali su temelj genetičkog inženjerstva. U području dijagnostike nastao je i ubrzano se razvija smjer određivanja specifičnih nukleotidnih sekvenci DNA i RNA, tzv. gensko ispitivanje. Takve se metode temelje na sposobnosti nukleinskih kiselina da hibridiziraju i tvore dvolančane strukture zbog interakcije komplementarnih nukleotida (AT, GC).

Za određivanje željenog slijeda DNA (ili RNA) posebno se izrađuje tzv. polinukleotidna sonda sa specifičnim baznim slijedom. U njegov sastav uvodi se posebna oznaka koja omogućuje prepoznavanje formiranja kompleksa.

Iako se ispitivanje gena ne može pripisati metodama imunokemijske analize, njegovo glavno načelo (interakcija komplementarnih struktura) metodički se provodi na isti način kao i indikatorske metode imunodijagnostike. Osim toga, metode ispitivanja gena omogućuju popunjavanje podataka o uzročniku infekcije u nedostatku njegove fenotipske ekspresije (virusi ugrađeni u genom, "tihi" geni).

Za analizu DNA, uzorak se podvrgava denaturaciji kako bi se dobile jednolančane strukture s kojima reagiraju molekule DNA ili RNAprobe. Za pripremu sondi koriste se ili različiti dijelovi DNA (ili RNA) izolirani iz prirodnog izvora (na primjer, jedan ili drugi mikroorganizam), obično predstavljeni kao genetske sekvence kao dio vektorskih plazmida, ili kemijski sintetizirani oligonukleotidi. U nekim se slučajevima kao sonda koriste pripravci genomske DNA hidrolizirane u fragmente, ponekad pripravci RNA, osobito često ribosomske RNA. Kao oznaka koriste se isti pokazatelji kao u različite vrste imunokemijska analiza: radioaktivni izotopi, fluoresceini, biotop (s daljnjom manifestacijom avidinenzimskim kompleksom) itd.

Redoslijed analize određen je svojstvima dostupne sonde

Trenutno se sve više koriste komercijalni setovi koji sadrže sve potrebne sastojke.

U većini slučajeva postupak analize može se podijeliti u sljedeće faze: priprema uzorka (uključujući ekstrakciju DNA i denaturaciju), fiksacija uzorka na nosač (najčešće polimerni membranski filter), prehibridizacija, sama hibridizacija, pranje nevezanih proizvoda, otkrivanje. U nedostatku standardne pripreme DNA ili RNA sonde, ona se prvo dobiva i označava.

Za pripremu uzorka može biti potrebno "uzgojiti" ispitni materijal kako bi se identificirale pojedinačne bakterijske kolonije ili povećala koncentracija virusa u staničnoj kulturi. Također se provodi izravna analiza uzoraka krvnog seruma, urina, krvnih stanica ili cijele krvi na prisutnost uzročnika infekcije. Za oslobađanje nukleinskih kiselina iz sastava stanične strukture provodi se liza stanica, au nekim slučajevima preparat DNA pročišćava se fenolom.

Denaturacija DNA, tj. njezin prijelaz u jednolančani oblik, događa se tijekom obrade alkalijama. Uzorak nukleinske kiseline zatim se fiksira na nosaču od nitroceluloze ili najlonske membrane, obično inkubacijom od 10 minuta do 4 sata na 80°C pod vakuumom. Nadalje, u procesu predhibridizacije postiže se inaktivacija slobodnih veznih mjesta kako bi se smanjila nespecifična interakcija sonde s membranom. Proces hibridizacije traje od 2 do 20 sati, ovisno o koncentraciji DNA u uzorku, koncentraciji korištene sonde i njezinoj veličini.

Nakon što je hibridizacija završena i nevezani produkti isprani, nastali kompleks se otkriva. Ako sonda sadrži radioaktivnu oznaku, tada se membrana izlaže fotografskom filmu kako bi se očitovala reakcija (autoradiografija). Za ostale oznake koristite odgovarajuće postupke.

Najviše obećava proizvodnja neradioaktivnih (tzv. hladnih) sondi. Na istoj osnovi razvija se tehnika hibridizacije koja omogućuje utvrđivanje prisutnosti patogena u preparatima rezova, punkcijama tkiva, što je posebno važno u patomorfološkoj analizi (hibridizacija in situ).

Bitan korak u razvoju metoda ispitivanja gena bila je uporaba reakcije pojačanja polimerazom (PCR). Ovaj pristup omogućuje povećanje koncentracije specifične (prethodno poznate) sekvence DNA u uzorku sintetiziranjem višestrukih kopija in vitro. Za izvođenje reakcije dodaje se pripravak enzima DNA polimeraze, višak deoksinukleotida za sintezu i takozvani primeri, dvije vrste oligonukleotida od 20-25 baza koji odgovaraju terminalnim dijelovima sekvence DNA od interesa, dodaju se u Uzorak DNK koji se proučava. Jedan od početnica mora biti kopija početka područja čitanja kodirajućeg lanca DNK u smjeru čitanja 53, a drugi mora biti kopija suprotnog kraja nekodirajućeg lanca. Zatim se sa svakim ciklusom reakcije polimeraze broj kopija DNK udvostručuje.

Za vezanje početnica potrebna je denaturacija (taljenje) DNA na 94°C, nakon čega slijedi dovođenje smjese na 4055°C.

Za izvođenje reakcije dizajnirani su programabilni inkubatori za mikrouzorke koji lako mijenjaju temperaturne promjene koje su optimalne za svaki stupanj reakcije.

Reakcija amplifikacije može značajno povećati osjetljivost analize tijekom sondiranja gena, što je posebno važno pri niskim koncentracijama uzročnika infekcije.

Jedna od značajnih prednosti sondiranja gena s amplificiranjem je mogućnost proučavanja submikroskopske količine patološkog materijala.

Druga značajka metode, važnija za analizu infektivnog materijala, jest mogućnost detekcije skrivenih (tihih) gena. Metode vezane uz primjenu genskog sondiranja sigurno će se sve više uvoditi u praksu dijagnosticiranja zaraznih bolesti kako budu postajale jednostavnije i jeftinije.

ELISA i RIF metode su uglavnom kvalitativne ili polukvantitativne. Pri vrlo niskim koncentracijama komponenti, stvaranje kompleksa antigen-antitijelo ne može se registrirati ni vizualno ni jednostavnim instrumentalnim sredstvima. Indikacija kompleksa antigena protutijela u takvim slučajevima može se provesti ako jedna od početnih komponenti antigena ili protutijela uvodi oznaku koja se može lako otkriti u koncentracijama usporedivim s koncentracijom analita koji se određuje.

Radioaktivni izotopi (na primjer, 125I), fluorescentne tvari i enzimi mogu se koristiti kao oznaka.

Ovisno o korištenoj oznaci, postoje radioimune (RIA), fluorescentne imune (FIA), enzimske imunotestove (ELISA) metode analize itd. posljednjih godinaširok praktičnu upotrebu dobio ELISA test, što je povezano s mogućnošću kvantitativnih određivanja, visokom osjetljivošću, specifičnošću i automatizacijom računovodstva.

ELISA metode analize skupina metoda koje omogućuju otkrivanje kompleksa antigena protutijela pomoću supstrata koji je cijepan enzimom uz pojavu boje.

Bit metode leži u kombinaciji komponenti reakcije antigena protutijela s izmjerenom enzimskom oznakom. Antigen ili protutijelo koje reagira obilježeno je enzimom. Po transformaciji supstrata pod djelovanjem enzima može se suditi o količini komponente reakcije antigen-antitijelo koja je ušla u interakciju. Enzim u ovom slučaju služi kao marker imunološkog odgovora i omogućuje vam da ga promatrate vizualno ili instrumentalno.

Enzimi su vrlo prikladne oznake jer im njihova katalitička svojstva omogućuju da djeluju kao pojačivači, budući da jedna molekula enzima može proizvesti više od 1 x 105 molekula katalitičkog proizvoda u minuti. Potrebno je odabrati enzim koji dugo zadržava svoju katalitičku aktivnost, ne gubi je vezanjem na antigen ili protutijelo i ima visoku specifičnost u odnosu na supstrat.

Glavne metode dobivanja antitijela ili antigena obilježenih enzimom, konjugatima: kemijski, imunološki i genetski inženjering. Za ELISA se najčešće koriste enzimi: peroksidaza hrena, alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.

Za detekciju aktivnosti enzima u kompleksu antigen-antitijelo u svrhu vizualnog i instrumentalnog registriranja reakcije koriste se kromogeni supstrati čije otopine, u početku bezbojne, tijekom enzimske reakcije poprimaju boju čiji intenzitet proporcionalna je količini enzima. Tako se za otkrivanje aktivnosti peroksidaze hrena u čvrstoj fazi ELISA kao supstrat koristi 5-aminosalicilna kiselina koja daje intenzivnu smeđu boju, ortofenilendiamin koji stvara narančastožutu boju. Za otkrivanje aktivnosti alkalne fosfataze i α-galatozidaze koriste se nitrofenilfosfati odnosno nitrofenilgalaktozidi.

Rezultat reakcije u nastanku obojenog produkta određuje se vizualno ili pomoću spektrofotometra koji mjeri apsorpciju svjetlosti određene valne duljine.

Postoje mnoge mogućnosti za postavljanje ELISA testa. Postoje homogene i heterogene varijante.

Prema načinu postavljanja razlikuju se kompetitivne i nekompetitivne ELISA metode. Ako su u prvoj fazi u sustavu prisutni samo analizirani spoj i njegovi odgovarajući centri za vezanje (antigen i specifična protutijela), tada je metoda nekompetitivna. Ako su analizirani spoj (antigen) i njegov analog (enzimom obilježeni antigen) prisutni u prvoj fazi, natječući se međusobno za vezanje na specifične vezne centre (antitijela) prisutna u nedostatku, tada je metoda kompetitivna. U ovom slučaju, što više ispitivani antigen sadrži otopinu, to je manja količina vezanih obilježenih antigena.

METODA FLUORESCENTNIH ANTITIJELA (MFA) ili IMUNOFLUORESCENTNE REAKCIJE (RIF)

Imunofluorescentna metoda je metoda izbora za brzu detekciju i identifikaciju nepoznatog mikroorganizma u ispitivanom materijalu.

Ag + AT + elektrolit = UV svjetleći kompleks

Mikrobni serum obilježen fluorokromom

Boja fluorescein izotiocijanat se često koristi FITC

U ovoj studiji koristi se fluorescentni mikroskop.

RIF inscenacija

Na bris se nanese 30 µl otopine antitijela obilježenih FITC-om.

Stavite čašu u vlažnu komoru i inkubirajte na sobnoj temperaturi 20-25 minuta ili u termostatu na 37°C 15 minuta.

Isperite staklo u tekućoj vodi iz slavine 2 minute, isperite destiliranom vodom i osušite na zraku.

Kap tekućine za postavljanje nanese se na osušeni razmaz, razmaz se pokrije pokrovnim stakalcem i mikroskopira pomoću fluorescentnog mikroskopa ili fluorescentnog nastavka na konvencionalni optički mikroskop.

Reakcija aglutinacije.

Reakcija aglutinacije je prianjanje i taloženje mikrobnih ili drugih stanica (eritrocita) pod djelovanjem protutijela u prisutnosti elektrolita. Vidljivi učinak reakcije (fenomen aglutinacije) je stvaranje taloga, koji se naziva aglutinat.

Ova reakcija se koristi za serodijagnostika I seroidentifikacija. RA se koristi za serodijagnostiku (dokazivanje protutijela u krvnom serumu bolesnika) trbušni tifus i paratifusa(Vidalova reakcija), bruceloza(Ispravna reakcija), tularemija i leptospiroza. RA se koristi za seroididentifikaciju (određivanje vrste uzročnika izoliranog od bolesnika) kada crijevne infekcije veliki kašalj, kolera i tako dalje.

Komponentereakcije:

1. A antigen (aglutinogen) - to su cijele (neuništene) mikrobne ili druge stanice ( korpuskularni, netopljivi antigen). Aglutinogeni- to je suspenzija živ ili ubijeni mikrobne stanice ili bilo koje druge stanice. Antigeni mogu biti poznati ili nepoznati. Nepoznati aglutinogen je mikrobna kultura izolirana iz tijela bolesnika koju je potrebno odrediti. poznati antigen. dijagnostikum- dijagnostički lijek - suspenzija mrtvih mikrobi poznate vrste u fiziološkoj otopini. Ova suspenzija zamagljen (neproziran)), jer mikrobne stanice se ne otapaju, već ostaju netaknute. Poznati aglutinogen koristit će se za otkrivanje nepoznatih protutijela u serumu pacijenta.

2. Antitijela (aglutinin)- nalazi se u krvnom serumu. Antitijela također mogu biti nepoznata ili poznata. U krvnom serumu nalaze se nepoznata antitijela koja treba odrediti bolesna osoba. Poznata antitijela nalaze se u imunološki dijagnostički serumi, koji se zovu aglutinirajući serumi. Koriste se za seroididentifikaciju, tj. za određivanje nepoznatog antigena – vrsta mikrobne kulture.

3. elektrolit- 0,9% otopina natrijevog klorida.

Načini postavljanja RA.

1. Približni (ploča) RA- izvedeno na staklu. Na predmetno staklo nanesite 2 kapi seruma i 1 kap izotonične otopine. U jednu od kapi seruma i u kap izotonične otopine petljom se unosi mikrobna kultura i miješa. Kap izotonične otopine s klicama – kontrola antigena, kap serumi bez klica – kontrola antitijela, kap serum s mikrobima – iskustvo. Ako serum sadrži antitijela koja odgovaraju mikrobnim antigenima koji su pomiješani s njim, tada će se antitijela i antigeni međusobno specifično vezati i nakon 1-3 minute u pokusnoj kapi pojavit će se aglutinirane ljuskice. Kontrola antigena trebala bi biti mutna, a kontrola antitijela bistra. Računovodstvo za rezultate reakcije provodi se pojavom pahuljica aglutinata . Ako pahuljice ispadaju, reakcija je pozitivna, tj. antigen odgovara antitijelu, a antigen se može koristiti za identifikaciju antitijela, ili obrnuto. Ako zamućenje ostane, reakcija je negativna.

2. Produžena reakcija aglutinacije - provodi se u epruvetama. Prvo se pripremaju dvostruka razrjeđenja krvnog seruma bolesne osobe od 1:50 do 1:1600. U 6 epruveta ulije se 1 ml izotonične otopine natrijeva klorida. U prvu epruvetu doda se 1 ml krvnog seruma bolesnika u razrjeđenju 1:50, promiješa i dobije se razrjeđenje 1:100, zatim se 1 ml razrjeđenja 1:100 prenese u drugu epruvetu. te se dobije razrjeđenje 1:200 itd. Ostavljene su dvije epruvete za kontrolu antigena i seruma. U kontrolu seruma dodaje se samo serum razrijeđen u omjeru 1:50, u kontrolu antigena dodaje se samo antigen. U sve ostale epruvete dodaje se 0,1 ml antigena - dijagnostikuma (O- ili H-) i sve se epruvete stavljaju u termostat na 37°C 18-20 sati. Računovodstvo rezultata reakcije provodi se prema prirodi, količini nastalog taloga (aglutinata) i stupnju zamućenja. Računovodstvo se provodi samo sa sljedećim rezultatima u kontrolama: kontrola seruma - prozirna, kontrola antigena - mutna. O-antitijela daju sitnozrnati talog. H-protutijela – krupnozrnasta. Prema posljednjoj epruveti, u kojoj je još vidljiva reakcija aglutinacije, postavite dijagnostički titar.

Kod serodijagnostike bolesti važno je ne samo detektirati specifična protutijela na određeni uzročnik, već i identificirati njihov broj, tj. uspostaviti takav titar antitijela kada možemo govoriti o prisutnosti bolesti uzrokovane ovim uzročnikom. Taj se titar naziva dijagnostički titar. Na primjer, za dijagnosticiranje trbušnog tifusa potrebno je otkriti titar protutijela od 1:400, ali ne manje. Još točniji rezultati dobivaju se otkrivanjem povećanja protutijela u parnim serumima.Serum bolesnika uzima se na početku bolesti i nakon 3-5 i više dana. Ako se titar antitijela poveća za najmanje 4 puta, tada možemo govoriti o trenutnoj bolesti.

Cilj: Ovladati tehnikom postavljanja reakcije aglutinacije i reakcije precipitacije za dijagnostiku zaraznih bolesti.

Modul 1 Morfologija i fiziologija mikroorganizama. Infekcija. Imunitet.

Tema 16: Reakcija aglutinacije. reakcija taloženja.

Relevantnost teme. Pod, ispod imunitet podrazumijevaju otpornost organizma na infektivne i neinfektivne agense (patogene mikroorganizme, strane proteine ​​i druge tvari). Ti se agensi nazivaju antigeni. Imunitet je urođen ili stečen. Kongenitalna- kada se formiraju tkivni i humoralni zaštitni uređaji, koji uzrokuju imunitet na zarazne bolesti koje su naslijeđene.

Stečena- provodi ga imunološki sustav organizma u obliku stvaranja protutijela ili nakupljanja senzibiliziranih limfocita. Podijeljen je na prirodni i umjetni. Prema mehanizmu djelovanja dijeli se na aktivni i pasivni. U svim imunološkim reakcijama glavna komponenta je antigen.

glavna funkcija imunološki sustav, koji se sastoji od limfoidnog tkiva, je prepoznavanje stranih agenasa (antigena) i njihova neutralizacija.

Antigeni mogu ući u tijelo kroz Zračni putovi, probavnom traktu, kroz kožu i sluznicu. Svaki antigen potiče stvaranje specifičnih proteinskih tvari – protutijela.

Antigeni dijele se na potpune i donje (haptene). Potpuni antigeni potaknuti potpuni imunološki odgovor. Defektni antigeni ne uzrokuju samostalno imunološki odgovor, ali ponekad stječu ovu sposobnost kada su konjugirani s proteinskim nosačima velike molekularne težine. Osim toga postoje i antigeni: poluhapteni, proantigeni, heteroantigeni i izoantigeni.

Antitijela su ljudski ili životinjski serumski imunoglobulini. Protutijela se stvaraju nakon infekcije, te kao rezultat imunizacije oslabljenim ili ubijenim bakterijama, rikecijama, virusima, toksinima i drugim uzročnicima. Antitijela- proteini imunoglobulina kemijski sastav spadaju u glikoproteine. Prema građi i imunobiološkim svojstvima imunoglobulini se dijele na 5 razreda: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normalna antitijela pronađen u ljudi i životinja koje nisu imunizirane. Specifična antitijela nastaju kao posljedica infekcije ili imunizacije.

Reakcija između antitijela i antigena naziva se serološki. Serološke reakcije su vrlo specifične i koriste se u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti. Postoje reakcije aglutinacije i precipitacije.

1. Reakcija aglutinacije (RA) temelji se na interakciji antigena (aglutinogena) i protutijela (aglutinina), pri čemu dolazi do aglutinacije i taloženja mikrobnih tijela u prisutnosti elektrolita. Postoje različite modifikacije formulacije reakcije aglutinacije.

Najveća vrijednost imati:

- Makroskopska (raspoređena) aglutinacija u epruvetama. U serum bolesnika dodaje se suspenzija mikroba (diagnosticum) i nakon 1 sata u termostatu na temperaturi od 37 stupnjeva bilježi se razrjeđenje (titar) seruma pri kojem je nastala reakcija. Reakcija aglutinacije se smatra pozitivnom kada se na dnu epruvete formira talog s izraženim bistrenjem supernatanta. Taj se talog naziva aglutinatom.

Prema prirodi aglutinata razlikujemo sitnozrnatu (O) i krupnozrnastu (H) aglutinaciju. Za otkrivanje sitnozrnatog aglutinata koristi se aglutinoskop. Obračunavanje rezultata počinje s kontrolnim epruvetama. Zadnje razrjeđenje seruma u kojem se uoči aglutinacija smatra se njegovim titrom.

Svrha reakcije: otkrivanje antitijela u serumu bolesnika.

- mikroskopski (ubrzani) ) približna aglutinacija na staklu. Kap bakterijske kulture dodaje se kapi dijagnostičkog imunološkog seruma i ravnomjerno miješa. Reakcija se nastavlja na sobnoj temperaturi nakon 5-10 minuta. Zatim se pravi račun. Uz pozitivnu reakciju u kapi seruma, bilježi se nakupljanje bakterija u obliku zrna ili pahuljica. Svrha reakcije: odrediti vrstu uzročnika prema poznatom dijagnostičkom serumu.

- Reakcija neizravne (pasivne) hemaglutinacije (RNGA). Bit ove reakcije leži u činjenici da su eritrociti ovna sposobni adsorbirati antigene na svojoj površini. Pod utjecajem specifičnih protutijela eritrociti se lijepe i talože, stvarajući na dnu hemaglutinat. Reakcija je vrlo osjetljiva i specifična. RNGA vam omogućuje otkrivanje minimalni iznos antitijela i defektnih polisaharidnih antigena. Ova reakcija se koristi u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti (abdominalne i tifus, paratifus, tuberkuloza itd.).

2. Reakcija taloženja (RP ) – taloženje kompleksa antigen-antitijelo. Glavna razlika između RP i RA je u tome što se kod RA koristi korpuskularni antigen, dok je kod RP antigen koloidna tvar proteinske ili polisaharidne prirode. U ovoj se reakciji antigen naziva precipitinogen, a protutijela precipitini. Reakcija se stavlja u epruvete nanošenjem otopine antigena na imunološki serum. S optimalnim omjerom antigena i antitijela na granici

te otopine tvore taložni prsten. Ako se kao antigen koriste prokuhani i procijeđeni ekstrakti organa i tkiva, reakcija se naziva reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, koja se stavlja u dijagnozu antraks, kuga, tularemija itd.).

Široka uporaba dobivene reakcije taloženja u agaru: metoda jednostavne difuzije, metoda dvostruke difuzije.

Vrsta oborine je reakcija flokulacije- odrediti aktivnost toksoida ili antitoksičnog seruma. Osim toga, ova se reakcija može koristiti za određivanje toksigenosti sojeva Corynebacterium diphtheriae.

Specifični ciljevi:

· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunološkog odgovora;

· Opisati strukturu antigena, uključujući antigene mikroorganizama;

· Opisati mehanizam reakcije aglutinacije;

· Opišite mehanizam reakcije taloženja.

Biti u mogućnosti:

· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunološkog odgovora;

Opisati strukturu protutijela (različite klase imunoglobulina);

· Analizirati mehanizam interakcije protutijela s antigenima;

· Interpretirati rezultate reakcije aglutinacije;

· Interpretirati rezultate reakcije taloženja;

· Analizirajte rezultate.

Teorijska pitanja:

1. Definicija pojma "antigeni", "antitijela".

2. Uloga antigena kao induktora imunološkog odgovora.

3. Struktura protutijela (različite klase imunoglobulina).

4. Mehanizam interakcije protutijela s antigenima.

5. Reakcije imuniteta, njihova uloga u imunološkom odgovoru i dijagnostici zaraznih bolesti.

6. Mehanizam reakcije aglutinacije.

7. Mehanizam reakcije taloženja.

Praktični zadaci koji se izvode u nastavi:

1. Postavljanje reakcije aglutinacije za otkrivanje protutijela u serumu bolesnika.

2. Postavljanje reakcije mikroaglutinacije na staklu s dijagnostičkim serumima za identifikaciju čiste bakterijske kulture.

3. Procjena rezultata reakcije aglutinacije.

4. Postavljanje reakcije taloženja za otkrivanje bakterijskog antigena.

5. Procjena rezultata reakcije taloženja.

6. Procjena rezultata reakcije neizravne hemaglutinacije.

7. Registracija protokola.

Književnost:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologija s virologijom i imunologijom - Kijev: Viša škola, 1992. - 431 str.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologija.- M.: Medicina, 1998.- 336s.

3. Medicinska mikrobiologija /Uredio V.P. Pokrovsky. - M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, imunologija i virologija / Udžbenik za medicinska sveučilišta, St. Petersburg: "Posebna literatura", 1998.- 592p.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologija / Udžbenik - 2. izdanje, revidirano. i dodati - M .: Medicina, 1983.- 512s.

6. Bilješke s predavanja.

Dodatna literatura:

1. Titov M.V. zarazne bolesti.- K., 1995.- 321s.

2. Shuvalova E.P. Zarazne bolesti - M .: Medicina, 1990. - 559s.

Aglutinacija krvi je aglutinacija i taloženje crvenih krvnih stanica, bakterija i drugih stanica koje nose antigene.

Proces se odvija pod utjecajem aglutinina, koji su specifične tvari. Uloga ovih tvari su lektini ili antitijela.

Moguće vrste aglutinacije u određivanju krvne grupe

Aglutinacija je specifična i nespecifična. U prvom slučaju, reakcija se odvija uz sudjelovanje tri komponente:

• antigeni;
• protutijela;
• elektroliti (koristi se izotonična otopina).

Za određivanje krvne grupe koriste se sve moguće vrste aglutinacije, ali to nije jedini slučaj.

U koju svrhu se koristi?

Test aglutinacije krvi koristi se za identifikaciju uzročnika zarazne bolesti. Pritom se taloži, a lako ju je otkriti u sedimentu. Ovaj se postupak koristi, kao što je gore spomenuto, i o tome će se dalje raspravljati.

Koje su značajke?

Crvena krvna zrnca sadrže antigene tipa A i B. Vežu se na ά, odnosno β protutijela. Krvne grupe i reakcije aglutinacije:

• 1, 0 (ά, β) - na površini eritrocita nema antigena;
• 2, A (β) - prisutni su antigen A i antitijelo β;
• 3, B (ά) - sadrži antigen B i antitijelo ά;
• 4, AB (00) - dva antigena su prisutna, antitijela su odsutna.

Vrijedno je napomenuti da su antigeni već uočeni u embriju. Što se tiče antitijela, ona se pojavljuju nakon rođenja, u prvom mjesecu života.

Kompatibilnost ljudi ovisi o krvnoj grupi. To je razlog odbacivanja fetusa od strane majčinog tijela. Drugim riječima, ona ima antitijela na krvne antigene nerođenog djeteta. U tom slučaju dolazi do nekompatibilnosti. Osim toga, pri transfuziji se mora voditi računa o krvnoj grupi.

Priprema

Krvne grupe i reakcije aglutinacije kompatibilni su pojmovi koji se često koriste u medicini.

Prije testa važno je slijediti određene upute. Potrebno je privremeno isključiti uporabu određenih proizvoda i lijekovi. To će pomoći da rezultati budu točniji. Preporuke koje treba slijediti propisuje liječnik. Činjenica je da različiti laboratoriji možda nemaju iste raspone dobivenih vrijednosti, odnosno malo se razlikuju.

Uvjeti za ispitivanje

Kako bi se krvna grupa točno odredila, važno je odabrati odgovarajuću opremu. To uključuje:

• i pipeta;
• staklene šipke;
• standardni izohemaglutinirajući serumi;
• suhe zemljane ploče, koje su podijeljene u 4 sektora.

Postoje zahtjevi za uvjete testa:

• dnevna svjetlost;
• temperatura u sobi je iznad +16 ˚S;
• korištenje volumena krvi i seruma u omjeru 1:10;
• Pouzdani rezultati postižu se unutar 5 minuta.

Gore su navedeni glavni uvjeti i alati. Aglutinacija krvi može se provesti na nekoliko načina, a svaki od njih postavlja pojedinačne zahtjeve.

Metode

Moguće metode određivanja krvne grupe pomoću aglutinacije:

• standardna metoda;
• križna reakcija;
• korištenje tsoliklona;
• ekspresna metoda pomoću seta "Erythrotest-Groupcard".

Standardna metoda

Aglutinacija krvi očituje se pomoću crvenih krvnih zrnaca bolesnika. Koriste se i standardni serumi koji sadrže poznate antigene.

Na ravnu ploču stavi se po 1 kap od četiri seruma. Zatim se staklenim štapićima na njega unosi krv pacijenta koju treba pregledati. U ovom slučaju prikladno je koristiti kapaljke. Omjer bi trebao biti 1:10. Serum i krv se lagano miješaju. Unutar pet minuta možete procijeniti.

Dešifriranje rezultata testa na jednostavan način

Nakon navedenog vremena u kapima seruma uočava se prosvjetljenje. Kod nekih možete vidjeti da je došlo do aglutinacije eritrocita (male ljuskice), kod drugih je nema.

Postoje sljedeće mogućnosti:

• nema reakcije u svim uzorcima seruma - skupina 1;
• koagulacija se pojavila posvuda, osim u 2 uzorka - skupina 2;
• nema reakcije samo u uzorku 3 - skupina 3;
• aglutinacija je bila posvuda - grupa 4.

Dakle, glavna stvar je pravilno rasporediti serum. Tada neće biti teško dešifrirati rezultat. Ako je aglutinacija krvi slaba, preporučuje se ponovno testiranje. U slučaju malih ljuskica, pregledaju se pod mikroskopom.

unakrsna reakcija

Ponekad na jednostavan način nemoguće je točno odrediti krvnu grupu. Aglutinacija se u ovom slučaju provodi metodom križne reakcije. Za razliku od prve verzije testa, ovdje su važni standardni eritrociti. Bolesnikova krv se uzme u epruvetu, centrifugira, a zatim se pipetom ispumpa serum za daljnje istraživanje.

Stavlja se na pločicu u količini od 2 kapi, zatim se dodaju standardna crvena krvna zrnca skupine A i B. Sadržaj se miješa mućkanjem posude.

Rezultati metode križne reakcije

Nakon pet minuta, uzorci su spremni za pregled. Opcije su:

• vezivanje se dogodilo u obje kapi - 1 grupa;
• pahuljice nisu uočene ni u jednom uzorku - skupina 4;
• proces je vidljiv u jednom uzorku - 2 ili 3 skupine (ovisi gdje se točno zgrušala krv).

Zoliklonska metoda

Za određivanje krvne grupe, aglutinacija na ovaj način provodi se pomoću sintetskih nadomjestaka seruma. Nazivaju se tsolikloni. Sadrže umjetne zamjene za ά i β-aglutine poznate kao eritrotestovi (ružičasti odnosno plavi). Reakcija se događa između njih i crvenih krvnih stanica pacijenta.

Ova metoda je najtočnija i pouzdana. Uglavnom, ne zahtijeva ponovno ispitivanje. Evaluacija rezultata provodi se na isti način kao u slučaju standardne metode. Posebnost je u tome što se mora nužno potvrditi reakcijom s određenim sintetskim nadomjestkom (anti-AB). Osim toga, ne opaža se lijepljenje u njemu kada se doda otopina natrijevog klorida.

Ekspresna metoda sa setom "Erythrotest-Groupcards"

Uzimajući u obzir moguće metode analize u određivanju krvne grupe, vrijedi napomenuti da ova metoda ima svoje karakteristike. Oni leže u činjenici da se rezultat može ocijeniti ne samo u laboratoriju, već i na terenu. Za studiju se koristi poseban set. Uključuje karticu s jažicom s osušenim reagensima koji su već prisutni na dnu. Uz anti-AB, anti-A i anti-B, za određivanje Rh faktora koriste se i anti-D.

Ova metoda ne zahtijeva posebnu pripremu, dopušteno je koristiti krv uzetu iz prsta, dopuštena je prisutnost konzervansa u njoj. Najprije u svaku jažicu morate dodati kap vode da se sastojci otope. Nakon toga dodaje se krv, lagano miješa. Za tri minute bit će primljen rezultat.

Lažna aglutinacija

Ponekad podaci dobiveni nakon testa nisu istiniti. Ovaj fenomen ovisi o određenim čimbenicima.

Postoje tri vrste lažno pozitivnih rezultata:

Pseudoaglutinacija. Ne dolazi do pravog povezivanja, eritrociti se jednostavno savijaju u obliku stupaca novčića. Ako dodate par kapi fiziološke otopine, raspadaju se. Sličan fenomen se prepoznaje pod mikroskopom.

Hladna aglutinacija krvi. Takva se reakcija opaža ako su uvjeti za studiju bili nepovoljni. Kad je temperatura ispod +16 ˚C, može doći do lijepljenja.

Panaglutinacija. Ako postoji infekcija u krvi, rezultati testa mogu biti lažni. Ova pojava je također moguća u slučaju onkološke bolesti, sa sepsom.

Aglutinacija je vrlo važna u medicini. Omogućuje ne samo određivanje krvne grupe, već i prepoznavanje uzročnika bolesti, kao i prisutnost infekcija. Glavna stvar je slijediti preporuke liječnika prilikom pripreme za ovaj postupak. Što se tiče medicinskog osoblja, njihov zadatak je stvoriti povoljne uvjete i pridržavati se svih pravila. Samo tako se može postići točne rezultate prilikom izvođenja aglutinacije krvi.