Coombsov test direktno i indirektno gdje treba raditi. Coombsov test: direktan i indirektan
Hemolitička anemija, uzrokovane autoimunim tijelima koja su usmjerena protiv vlastitih crvenih krvnih zrnaca, nisu precizno razjašnjeni. Međutim, pretpostavlja se da neki faktori (na primjer, virus, abnormalni protein) mijenjaju eritrocite na način da ih tijelo već percipira kao “nešto strano” i hvata se u koštac s njima uz pomoć antitijela. Prema drugoj teoriji, antitijela usmjerena protiv eritrocita nastaju gotovo slučajno tokom formiranja abnormalnih proteinskih tijela plazme kod određenih bolesti. Takva proteinska tijela, isto tako "slučajno", mogu dati reakcije koje se mogu koristiti za postavljanje dijagnoze (na primjer, poznato je da virusna pneumonija daje pozitivnu Wassermannu reakciju, pozitivnu Paul-Bunnelovu reakciju i reakciju hladne aglutinacije).
Postoje dva glavne vrste autoantitijela s hemolitičkom anemijom, i to: topla antitijela (reaguju na 37 °) i hladna antitijela (čija reaktivnost raste kako se temperatura približava nuli). Topla antitela su češća od hladnih. Dacie je otkrio da su topli hemolizini dvostruko češći od hladnih hemolizina. Hemolizini i aglutinini nisu suštinski različita antitijela: razlikuju se samo po prirodi svog djelovanja. Aglutinini aglutiniraju crvena krvna zrnca, dok ih hemolizini čine osjetljivijima na složen proces hemoliza (komplement!). Autoantitijela, fiksirajući se na eritrocite, formiraju kompleks eritrocit-globin. Ovaj kompleks se otkriva upotrebom antiglobinskog Coombs testa.
Coombsov test obavljeno sa Coombsovim serumom, za čiju pripremu se zec senzibilizira ljudskim serumom protiv kojeg se u zečjem serumu stvaraju antitijela. Pod djelovanjem tako senzibiliziranog seruma na ljudske eritrocite dolazi do njihove aglutinacije ako su receptori eritrocita zauzeti blokirajućim antitijelima. Budući da su ova blokirajuća antitijela izvedena iz ljudskog seruma, aglutiniraju sa zečjim serumom koji je osjetljiv na ljudsku plazmu i koji sadrži precipitine. Ova reakcija se naziva Coombsov test; Za hemolitička anemija na osnovu autoimunih tijela (Lotit) gotovo je specifičan (vidi Maier za detalje).
Općenito, s hemolitičkom anemijom s primarnim oštećenjem eritrocita, Coombsov test je negativan, a sa stečenim je pozitivan. Međutim, postoje neki izuzeci od ovog pravila: lažno pozitivan Coombsov test je pronađen za vrijeme kriza konstitucijske hemolitičke anemije, te u nizak stepen- ponekad i nakon splenektomije, kod reumatske groznice, sarkoidoze, nakon čestih transfuzija krvi i kod sistemskog eritematoznog lupusa. Naravno, kod stečene hemolitičke anemije bez formiranja autoimunih tijela negativna je.
Hemolitička anemija uzrokovane autoimunim tijelima mogu se podijeliti na:
a) akutna, subakutna i hronične forme, kao i na
b) idiopatski sa nepoznatom etiologijom i c) simptomatski [virusna pneumonija (samo hladni aglutinini), hronična limfatična leukemija, retikulosarkom, limfosarkom, sistemski eritematozni lupus (pretežno topli, retko hladni), tumori jajnika (agglutinini) (M) zaposleni)).
c) simptomatska [virusna pneumonija (samo hladni aglutinini), hronična limfna leukemija, retikulosarkom, limfosarkom, sistemski eritematozni lupus (pretežno topli, rjeđe hladni aglutinini), sifilis (hladni aglutinini), tumori jajnika i dr.).
Klinika za hemolitičku anemiju, koji se razvijaju pod utjecajem autoimunih tijela, vrlo je raznolik, te je stoga teško moguće nacrtati njihovu opštu kliničku sliku. Podjednako su pogođene osobe svih uzrasta i oba pola. Ipak, čini se da su idiopatski oblici češći kod žena (Sacks i Workman).
Klinička slika idiopatskog oblika varira u zavisnosti od težine bolesti. U kroničnim slučajevima, početak je postepen, bolest traje dugi niz godina s čestim egzacerbacijama. Ozbiljnost anemije varira u zavisnosti od stepena hemolize. Primjećuje se pad hemoglobina do 10%, u drugim slučajevima hemoglobin se dugo zadržava za 50-60%. Intenzitet retikulocitoze i ikterične boje kože i seruma odgovara stepenu hemolize. Bilirubin se vrlo rijetko nalazi u urinu, jer ne prolazi kroz bubrege, ali se opaža hemoglobinurija. Slezena je u kroničnim slučajevima često uvećana i može dostići čak i vrlo značajne veličine, dok je u drugim slučajevima još uvijek opipljiva. Jetra je rijetko uvećana.
U krvi u većini slučajeva vidi se makrocitoza akutne faze ima i mnogo mikrocita, normoblastoza i polihromazija retko izostaju, leukocitoza može dostići 30.000, trombociti su normalni. U nekim slučajevima, međutim, postoji izražena trombocitopenija. Evans ove slučajeve objašnjava istovremenim prisustvom antitijela protiv trombocita, tako da postoji i hemolitička anemija i trombocitopenija zbog djelovanja autoimunih tjelesni sindrom Evans. Osmotska rezistencija je blago smanjena, ali ne u istoj mjeri i ne tako trajno kao kod konstitucijske sferične anemije. Test otpornosti na toplotu (Hegglin-Maier) nakon 6 sati također može dati blagu hemolizu (sopstveno zapažanje), ali u manjoj mjeri nego kod Marchiafavine anemije. Hemosiderin se također nalazi u urinu (sopstveno zapažanje).
Antiglobulinski test dizajniran za otkrivanje nepotpunih anti-eritrocitnih antitijela predložili su Coombs, Morant, Reis 1945. godine, a kasnije je nazvan Coombsov test. Suština ove metode leži u činjenici da antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humane imunoglobuline, u reakciji sa eritrocitima koji su senzibilizirani sa nekompletnim antitijelima, dovodi do njihove aglutinacije.
Ovisno o tome da li su antitijela fiksirana na površini crvenih krvnih stanica ili su slobodna u krvnoj plazmi, koristi se direktni ili indirektni Coombsov test.
Direktan Coombsov test se izvodi u slučajevima kada postoji razlog za vjerovanje da su crvena krvna zrnca koja se proučavaju već in vivo su senzibilizirani odgovarajućim antitelima, tj. Prva faza reakcije - fiksacija antitijela na površini eritrocita - nastupila je u tijelu, a naknadno dodavanje antiglobulinskog seruma uzrokuje aglutinaciju senzibiliziranih stanica.
Koristeći indirektni Coombs test, otkrivaju se nepotpuna antitijela prisutna u test serumu. U ovom slučaju, reakcija se odvija u dvije faze. Prva faza je inkubacija test eritrocita sa test serumom, tokom koje se antitela sadržana u uzorku test seruma fiksiraju na površinu eritrocita. Druga faza je dodavanje antiglobulinskog seruma.
Do sada se Coombsov test široko koristio u laboratorijskoj praksi za dijagnozu imunopatoloških stanja, posebno kod autoimunih hemolitičkih anemija, koje karakteriziraju uništavanje eritrocita zbog vezivanja ćelijske membrane za antitijela i (ili) komponente sistem komplementa. Uz njegovu pomoć otkriva se prisustvo Ig G (obično Ig G1 i Ig G3) na membrani eritrocita, koji može aktivirati komplement, a ponekad i komplement (C3d). Međutim, u akutnom periodu bolesti, zbog uništavanja eritrocita, na kojima veliki broj antitijela, s hemolitičkom krizom, kao i sa nedovoljnom količinom antitijela u kroničnom toku bolesti, može se primijetiti negativan direktni Coombsov test.
Mora se naglasiti da ostaje indirektni Coombsov test najbolja metoda individualni odabir transfuzijskih medija, jer vam omogućava da najpreciznije odredite individualnu kompatibilnost donora i primatelja za antigene eritrocita.
Dodatni direktni antiglobulinski test na prisustvo autoantitela preporučuje se u pregledu svih primaoca organa i tkiva u pretransplantacionom periodu i primaoca hematopoetskih matičnih ćelija i nakon transplantacije.
Pored imunohematologije i transfuziologije, antiglobulinski testovi se široko koriste u dijagnostici niza patoloških stanja: kod hematoloških bolesti, uključujući i limfoproliferativna, u sistemske bolesti vezivno tkivo, Sjogrenova bolest, hronični aktivni hepatitis itd.
Coombsovi testovi se aktivno koriste u medicinskoj genetici i sudskoj medicini za određivanje površinskih antigena eritrocita.
Coombsov test je prilično dugotrajna istraživačka metoda koja zahtijeva posebnu pažnju u svojoj primjeni. Kada se koristi, postoje neke poteškoće povezane, posebno s tumačenjem slabo pozitivnih reakcija. Poznato je da lažne slabe pozitivne ili negativne reakcije pri izvođenju Coombsovih testova mogu biti rezultat nedovoljno efikasnog ispiranja eritrocita, neutralizacije antiglobulinskog reagensa tragovima seruma i kontakta sa neomašćenom površinom na koju se antiglobulin može fiksirati, gubi svoju aktivnost. Još jedan nedostatak Coombsovog testa je nestabilnost antiglobulinskog reagensa, čija priprema i skladištenje imaju određene karakteristike, što takođe otežava kvantifikaciju reakcije hemaglutinacije sa antiglobulinskim serumom.
Osim toga, studije koje su sproveli A. Holburn, D. Voak i dr. , pokazalo je da pretjerano tresenje tokom resuspendiranja suspenzije crvenih krvnih zrnaca može biti uzrok lažno negativnih rezultata. Pogrešni rezultati pri izvođenju antiglobulinskih testova mogu biti i zbog prisustva primesa antikomplementarnih antitela u antiglobulinskom reagensu, posebno na komponente komplementa C3d, C3c, C4c i C4d, koje se adsorbuju na površini test eritrocita tokom inkubacije i stvaraju pojava pozitivnog rezultata.
Ovi nedostaci se mogu lako otkloniti temeljnim pranjem uzoraka za ispitivanje i kontrolom uslova reakcije.
U posljednjoj deceniji, kako bi se smanjilo vrijeme izvođenja indirektnog Coombsovog testa i povećala njegova osjetljivost, izotonični rastvor niske jonske snage (LISS).
Neosporna prednost antiglobulinskih testova, prema brojnim autorima, je njihova visoka osjetljivost, koja znatno premašuje rezoluciju alternativne metode testovi koji se koriste za otkrivanje neaglutinirajućih antitijela.
Usporedili smo rezoluciju metoda za proučavanje krvnih seruma na prisustvo nekompletnih antitijela korištenjem poliglucinskog, želatinskog i antiglobulinskog seruma. U toku istraživanja praćeni su titri nekompletnih anti-D antitijela u 140 uzoraka seruma krvi izoimunih davalaca primjenom želatinskih, poliglukinskih i indirektnih antiglobulinskih testova. Prikaz ovih metoda je izvršen u skladu sa opšteprihvaćenim metodama.
Utvrđeno je da su metode za otkrivanje senzibilizacije eritrocita anti-D antitijelima u smislu rezolucije raspoređene na sljedeći način: najosjetljiviji je indirektni Coombsov test, zatim želatin test, a najmanje informativan poliglucinski test. Rezultati dobijeni u ovoj seriji eksperimenata u potpunosti odgovaraju podacima iz literature, što nam omogućava da zaključimo da je osjetljivost Coombsovih testova dovoljno visoka, što omogućava da se sa visokim stupnjem sigurnosti identificira prisustvo antieritrocitnih antitijela. u tijelu koje ne izazivaju aglutinaciju crvenih krvnih zrnaca.
Međutim, u praksi Coombsovih testova postoje slučajevi kada se ne otkriju nekompletna antitijela, iako klinička slika bolesti ili prethodna imunizacija ukazuje na njihovo moguće prisustvo. U takvim slučajevima može se pretpostaviti da količina antitijela nije dovoljna da bi se istaložila antiglobulinskim serumskim antitijelima.
Ovaj zaključak je potvrđen i vlastitim eksperimentom, u kojem je metodom analitičke mikroelektroforeze ćelija utvrđeno prisustvo anti-D antitijela na test eritrocitima, koja nisu otkrivena indirektnim Coombsovim testom. U ovoj seriji eksperimenata je eritrocitima, prethodno inkubiranim sa serumima dobijenim iz krvi imuniziranih donora, dodat antiglobulinski serum u periodu nastanka antitela u pokretu, tj. u periodu kada poznate metode, uključujući Coombsov test, nisu otkrile antitijela u njima.
U sprovedenim studijama, statistički je dokazano prisustvo nekompletnih antitela na površini eritrocita. značajna promjena vrijednosti elektroforetske pokretljivosti senzibiliziranih crvenih krvnih stanica nakon dodavanja antiglobulinskog seruma. Treba napomenuti da su naknadno otkrivena anti-D antitijela u krvnom serumu svih imuniziranih davalaca indirektnim Coombsovim testom.
Gillerand et al. također su pokazali da antiglobulinske testove karakterizira određeni prag osjetljivosti: pozitivan rezultat se bilježi samo kada je najmanje 500 Ig G molekula fiksirano na površini jednog eritrocita.
Osim toga, u literaturi postoje dokazi da mogući negativni Coombsov rezultat može biti posljedica niskog afiniteta antitijela koja senzibiliziraju crvena krvna zrnca, zbog čega se ona lako eluiraju s površine crvenih krvnih stanica tijekom pranja.
S obzirom na navedeno, može se zaključiti da u nekim slučajevima negativan rezultat Coombs testa još nije dokaz odsustva antitijela fiksiranih na površini eritrocita.
Poznato je da su Coombsove reakcije vrlo specifične i omogućavaju otkrivanje većine vrsta nepotpunih antitijela. Međutim, kako pokazuju neki eksperimentalni podaci, antiglobulinski testovi mogu biti pozitivni i u neimunološkim stanjima. E. Muirhead et al. drugog dana nakon primjene fenilhidrazina, psi su imali pozitivan Coombsov test. Ovako brza pojava pozitivne reakcije svedoči protiv njene imunološke prirode, već je povezana sa nespecifičnom adsorpcijom proteina na površini eritrocita.
M. Williams et al. utvrdili da klavulanska kiselina može izazvati i pozitivnu reakciju, koja je, prema autorima, povezana s nespecifičnom adsorpcijom proteina plazme na površini eritrocita. Sličan efekat je uočen i pri liječenju cefalosporinskim antibioticima.
Autori navedenih studija ističu neimunološku prirodu dobijenih pozitivnih rezultata Coombsovih testova i insistiraju na tome da su ove supstance sposobne da izazovu modifikaciju membrane crvenih krvnih zrnaca, usled čega eritrociti mogu da adsorbuju proteine (posebno, albumin), koji su normalno prisutni u krvnoj plazmi i ne posjeduju svojstva antitijela. Osim toga, moguće je da upravo ksenobiotik, adsorbiran na površini stanice, služi kao veza između stanične membrane i proteina plazme.
Za pravilno tumačenje rezultata postavljanja antiglobulinskih testova treba uzeti u obzir i kvantitativni odnos mladih i zrelih eritrocita u perifernoj krvi. Utvrđeno je da se retikulociti izolovani iz organizma tokom perioda pojačane regeneracije eritrona mogu aglutinirati antiglobulinskim serumom.
Pozitivan rezultat direktnog antiglobulinskog testa Koristi se i kod raznih patoloških stanja praćenih poremećajima imunološki sistem, upalnih procesašto dovodi do nespecifične adsorpcije antitijela različite specifičnosti na membrane eritrocita. Ovo sugerira da molekuli Ig G ne stupaju u interakciju s njima specifični antigeni eritrociti, ali samo fiksirani na površini proučavanih stanica.
Treba imati na umu da pri postavljanju Coombsovog testa u slučajevima bolesti koje karakterizira razvoj disproteinemije ili pojava paraproteina, pozitivan rezultat je zbog prisustva na površini eritrocita proteina koji nemaju svojstva antitela, što takođe ukazuje na nedovoljnu specifičnost antiglobulinskih testova u pogledu prirode proteina otkrivenog uz njihovu pomoć.
Dakle, kako pokazuju brojne studije, pozitivni rezultati direktnih i indirektnih antiglobulinskih testova nisu apsolutni dokaz prisustva antitijela, jer se pozitivne reakcije mogu uočiti i kod različitih patoloških stanja koja nisu povezana sa izosenzibilizacijom ili autosenzibilizacijom organizma. Stoga je samo poređenje rezultata nekoliko imunoseroloških metoda sa kliničku sliku bolest vam omogućava da u potpunosti procenite patološki proces u razvoju.
Pozitivan indirektni antiglobulinski test sa negativnim direktnim testom obično ukazuje na prisustvo slobodnih aloantitijela u test serumu, povezanih s prethodnim transfuzijama krvi ili trudnoćama.
Coombsov test je često pozitivan tokom egzacerbacije paroksizmalne noćna hemoglobinurija; pozitivan Coombsov test sa anti-C3 i anti-C3dg je marker bolesti hladnog aglutinina.
U slučajevima kada postoji visok rizik od razvoja hemolitička bolest novorođenčad, veliki značaj za dijagnostiku (najčešće u trudnoći) i po potrebi dinamičko praćenje pojave i promene titra antitela imaju rezultate direktnih i indirektnih antiglobulinskih testova. Najčešće je hemolitička bolest novorođenčeta povezana sa nekompatibilnošću majke i fetusa za antigen D, rjeđe za antigene AB0 sistema, a još rjeđe za druge antigene (C, c, K itd.). Nastala antitijela la, budući da su u pravilu nepotpuna antitijela Ig G klase, jasno se otkrivaju indirektnim antiglobulinskim testom. Kod ove bolesti od velikog je značaja tačno utvrđen titar i specifičnost otkrivenih antitela, jer postoji određena korelacija između nivoa antieritrocitnih antitela u krvi trudnice i moguće prognoze težine hemolitičke bolesti.
Indirektni Coombsov test je također potreban u kliničku praksu kako bi se osigurala sigurna transfuzijska terapija. Njegova implementacija je obavezna komponenta imunohematoloških studija davalaca i različitih kategorija primatelja, kao i rutinskih pregleda svih pacijenata zdravstvenih ustanova kojima je potrebna transfuzija krvi i njenih komponenti.
Indirektni antiglobulinski test koristi se u sljedećim slučajevima:
Za preciznije određivanje Rh pripadnosti (antigen D) sa nejasnim rezultatima određivanja Rh faktora drugim metodama (poliglucin, želatin, itd.);
Za otkrivanje slabih antigena eritrocita (Kell, Duffy, Kidd, Lewis, itd. sistemi) i antitela na ove antigene;
Za detekciju i identifikaciju aloimunih antieritrocitnih antitijela, uključujući antitijela koja uzrokuju hemolitičke posttransfuzijske reakcije;
Utvrditi prisustvo imunih antitela AB0 sistema u transfuzionim hemolitičkim komplikacijama;
Kao test kompatibilnosti za individualnu selekciju transfuzirane krvi i njenih komponenti.
Stoga je Coombsov test važan dijagnostički test koji se koristi u različitim oblastima medicine (hematologija, akušerstvo, reumatologija, transfuziologija, klinička i laboratorijska dijagnostika itd.). Poznavanje karakteristika Coombsovog testa pomoći će povećanju pouzdanosti rezultata i doprinijet će ispravnoj interpretaciji laboratorijskih podataka.
Književnost
1. Antitijela. Metode / ur. D. Cathy. — M.: Mir, 1991.
2. Bayramalibeyli I.E., Rahimov A.A., Gadzhiev A.B.. // Transfuzijska terapija anemije: udžbenik. vodič za doktore. - M.: Prakt. medicina, 2005. - S. 105-106.
3. Volkova O.Ya., Fregatova L.M., Levchenko L.B.// Transfuziologija. - 2006. - br. 2. - S. 39-62.
4. Donskov S.I.// Krvne grupe rezus sistema: teorija i praksa. - M.: VINITI RAN, 2005. - S. 180-186, 195.
5.Imunoserologija (normativni dokumenti) / komp. A.G. Bashlay, S.I. Donskov. — M.: VINITI RAN, 1998.
6.Istraživanje krvnog sistema u kliničkoj praksi / ur. G.I. Kozintsa, V.A. Makarov. — M.: Triada-X, 1997.
7. Levin V.I. Mehanizmu eritrodiereze i eritropoeze u periodu akutne posthemoragijske anemije: dr. sc. dis. …kand. med. nauke. - Minsk, 1968.
8. Rahimov A.A., Bairamalibeyli I.E.. // Osnove dijagnoze, prevencije i liječenja anemije. - M.: GOU VUNMTs Ministarstva zdravlja Ruske Federacije, 2002. - S. 204-209.
9. Čumakova E.D.. // Stvarni problemi hematologija i transfuziologija: materijali VI Kongresa hematologa i transfuziologa Republike Belorusije, Minsk, 24-25. maja 2007. / ur. A.I. Svirnovsky, M.P. Potapnjev. - Minsk: Republički naučno-praktični centar za hematologiju i transfuziologiju, 2007. - S. 50.
10. Coombs R., Mourant A., Race R. // Lancet. - 1945. - Vol. 2. - str. 15.
11. Freedman J. // J. Clin. Pathol. - 1979. - Vol. 32. - P. 1014-1018.
12. Holburn A.M. kontrola kvaliteta. Metode u hematologiji / ur. I. Cavill. - Edinburg: Churchill Livingstone, 1982. - Vol. 4. - P. 34-50.
13. Khan S.// CMAJ. - 2006. - Vol. 175, br. 8. - Str. 919.
14. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Vol. 63 (dodatak 7). - P. 719-721.
15. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Vol. 63 (dodatak 7). - P. 716-718.
16. Molthan L., Reidenberg M.M., Eihman M.F.// New Engl. J. Med. —1976. — Vol. 277. - P. 123-125.
17. Muirhead E.E., GrovesM., Brian S. // J. Lab. Clin. Med. —1954. — Vol. 44. - P. 902-903.
18. Rosse W.F.//Hosp. Prac. - 1995. - N 105.
19. Voak D., Downie D., Mooreb. et al. //Biotests Bull. - 1986. - Vol. 1. - P. 41-52.
20. Voak D., Haigh T., Downie D. et al. Mašine za pranje ćelija za antiglobulinske testove. Ponovljeno testiranje - nova metoda koja pokazuje neefikasnost jedne široko korišćene mašine - Sorvall CW1-AF2: izveštaj tehničkom ogranku DHSS, februar 1991.
21. Williams M.E., Thomas D., Harman C.P. et al. //Antimikrobna sredstva i kemoterapija. -1985. - str. 125-127.
22. Zarandona J.M., Yazer M.H. // CMAJ. - 2006. - Vol. 174, br. 3. - P. 305-307.
Medicinske vijesti. - 2008. - br. 3. - S. 33-36.
Pažnja! Članak je namijenjen medicinskim specijalistima. Ponovno štampanje ovog članka ili njegovih fragmenata na Internetu bez hiperveze na izvorni izvor smatra se kršenjem autorskih prava.
Coombsov test je specifičan laboratorijski test koji otkriva antitijela prisutna u ili na površini crvenih krvnih zrnaca. Ovaj postupak omogućava dijagnosticiranje imunološkog sistema, uključujući i novorođenčad, kao i identifikaciju hemolitičkih transfuzijskih reakcija. Coombsov test se aktivno koristi u sudskoj medicini i naučnoj genetici za određivanje antigena eritrocita. Usklađenost sa svim pravilima za provedbu takve analize omogućava vam da dobijete najpouzdaniji rezultat.
Svrha antiglobulinskog testa
Direktni Coombsov test vam omogućava da otkrijete anti-eritrocitna antitijela koja su fiksirana na crvenim krvnim zrncima. Pozitivna reakcija u takvoj studiji ukazuje na razvoj autoimunosti.Treba napomenuti da negativan rezultat ne isključuje prisustvo, jer su antitijela često u slobodnom obliku, odnosno nemaju veze sa crvenim krvnim zrncima. U takvim slučajevima, preporučljivo je provesti indirektni Coombsov test, koji će vam omogućiti da odredite autonomne supstance u
Kako se vrši analiza?
abortus venska krv pacijent se provodi ujutro na prazan želudac, uprkos činjenici da nisu pronađeni značajni faktori koji utiču na konačni rezultat takvog testa. Dozvoljeno je čuvanje uzetog materijala na temperaturi od 2 do 8 °C ne duže od sedam dana. Da bi ova studija bila što preciznija, puna krv mora biti dostavljena u laboratoriju u prva dva sata. U idealnom slučaju, Coombsov test bi trebao pokazati negativan rezultat, što ukazuje na odsustvo hemolitičkih promjena u tijelu.
Dešifrovanje zbroja
Coombsov test je prilično dugotrajna istraživačka metoda koja zahtijeva pažljivo i precizno izvođenje. Prilikom korištenja takvog testa mogu postojati određene poteškoće koje su povezane s pogrešnom interpretacijom konačnih rezultata zbog slabe manifestacije pozitivnih reakcija. Treba napomenuti da nepouzdanost analize – naime pozitivan Coombsov test – može biti rezultat neefikasnog ispiranja eritrocita, kontakta sa masnim
površine, kao i neutralizacija antiglobulinskih reagensa komponentama
serum. Još jedan nedostatak ove metode istraživanja je nestabilnost uzetog materijala, čije skladištenje ima određene karakteristike.
Lažno negativan rezultat može biti uzrokovan pretjeranim mućkanjem suspenzije eritrocita tokom resuspenzije. Pogrešni rezultati mogu biti i zbog prisustva kontaminanata antikomplementarnih antitijela koji se adsorbiraju tokom inkubacije na površini testiranih eritrocita, što rezultira pojavom pozitivnog rezultata. Ako se testni uzorci temeljito isperu i kontroliraju reakcijski uvjeti, ovi nedostaci se mogu lako otkloniti, što će povećati šanse za dobivanje najpouzdanijih pokazatelja Coombsovog testa.
Princip antiglobulina. Anti-eritrocitna antitijela parcijalnog tipa i molekule komplementa (C) smještene na površini eritrocita mogu se detektirati - direktnim testom - njihovom aglutinacijom u kontaktu sa životinjskim serumom koji sadrži antitijela na humani antiglobulin (antiglobulinski serum). Nepotpuna antitijela slobodna u serumu otkrivaju se - indirektnim testom - fiksiranjem na mješavinu normalnih eritrocita grupe 0, čiji svi antigeni pripadaju poznatom Rh sistemu, a zatim aglutiniraju pod utjecajem antiglobulinskog seruma.
Materijali, reagensi za antiglobulinski Coombs test: tube od 10/100 ml; graduirane pipete za 1,2 ml; Pasteurove pipete; tronošci; predmetne nepolirane naočare; 8,5‰ rastvor NaCl; eritrociti. Eritrociti pacijenta, kao i oni koji pripadaju grupi 0, dobiće se iz sveže uzete krvi na antikoagulansnoj supstanci (EDTA rastvor).
Izaberite eritrocite grupe 0 na način da potiču od normalnih pojedinaca i da sadrže sve Antigeni Rh sistema. Mogu se čuvati do 7 dana u autolognoj plazmi na +4°C. U nedostatku eritrocita grupe 0, može se koristiti poznati antigenski mozaik, mješavina eritrocita grupe 0, Rh-pozitivnih i Rh-negativnih eritrocita.
Serum pacijent treba biti svježe odabran.
Antiglobulinski serum u produkciji Instituta. I. Cantacuzino, dostupan je u liofilizovanom obliku u ampulama od 1 ml. Nakon rastvaranja, serum treba čuvati na -20°C.
Tehnika Coombsovog antiglobulinskog testa:
A) Direktan Coombsov test: isprati eritrocite pacijenta 3 puta sa 8,5‰ rastvorom NaCl.
Nanesite veliku kap razrjeđenja antiglobulinskog seruma na nekoliko stakalca, a pored toga malu kap sedimenta eritrocita pacijenta; miješati kapljice staklenim kutom. Ostavite pripremljeni materijal na stolu 5 minuta, a zatim ispitajte da li ima aglutinata. Ako je pozitivan, odredite maksimalni titar aglutinacije.
b) Indirektni Coombsov test: eritrociti grupe 0, Rh-pozitivni i Rh-negativni, isprati 3 puta sa 8,5‰ rastvorom NaCl i izložiti pacijentovom serumu brzinom od 2 kapi eritrocita na 8-10 kapi seruma, zatim 60 minuta, inkubirati na temperaturi od 37°S. Nakon toga ponovo tri puta operite eritrocite i postupite na njih antiglobulinskim serumom, prema uputstvu za direktni Coombs test.
Kad dođe o hladno aktivnim antitijelima senzibilizacija eritrocita grupe 0 provesti 60 min. na temperaturi od +4°S.
Bilješka: 1) Nemojte izvoditi direktan Coombsov test na eritrocitima koji su pohranjeni jedan ili više dana na temperaturi od +4°C ili sobnoj temperaturi, jer rezultati mogu biti lažno pozitivni zbog fiksacije nepotpunih, hladno aktivnih antitijela prisutnih u normalan serum. 2) U slučajevima teške hiperproteinemije, isprati eritrocite 4-5 puta i provjeriti odsustvo serumskih proteina u posljednjoj tekućini za ispiranje sulfosalicilnom kiselinom.
Mogući ostatak od 2 µg IgG/mL u sedimentu eritrocita može neutraliziraju antiglobulinski serum. Coombsov test se može izvesti i korištenjem monospecifičnih anti-IgG, -IgM, -IgA -C3 i -C4 seruma kako bi se razjasnio tip glubolina na površini eritrocita, na primjer, kod onih koji pate od autoimune hemolitičke anemije.
Coombsov test
Direktni Coombsov test je antiglobulinski test (aglutinacija gelom, koji omogućava detekciju kompletnih dvovalentnih antitijela), kojim se određuju antitijela IgG klase i C3 komponenta komplementa na površini eritrocita. Tipično, antitijela otkrivena direktnim Coombsovim testom imaju široku specifičnost koja nije povezana s dobro utvrđenim antigenom. Pozitivan direktan Coombsov test jasno ukazuje na prisustvo hemolitičke anemije kod pacijenta, iako nemaju svi pacijenti s pozitivnim direktnim antiglobulinskim testom ovu bolest. Približno 10% pacijenata sa antitijelima ili komponentama komplementa na membrani eritrocita ne može se otkriti direktnim Coombsovim testom (negativni test), ali, ipak, boluju od autoimune hemolitičke anemije. Da bi se razjasnila specifičnost antitijela u takvim slučajevima, koriste se testovi s njihovim eluiranjem. Direktni Coombsov test, pozitivan samo na komplement, obično je povezan s IgM antitijelima hladnog tipa. U ovom slučaju, IgM antitijela nisu prisutna na eritrocitima kada bazalna temperatura tijelo. Međutim, zbog činjenice da IgM antitijela aktivno fiksiraju komplement, a komplement ostaje na eritrocitima, kod ovog oblika autoimune hemolitičke anemije (hladna aglutininska bolest), Coombsov test će biti pozitivan samo na komplement.
Direktni Coombsov test je pozitivan kod autoimune hemolitičke anemije uzrokovane toplim antitijelima, autoimune anemije lijekova (kod uzimanja metildope do 20% pacijenata ima pozitivnu reakciju), adsorpcionog tipa hemolitičke anemije, imunokompleksnog tipa hemolitičke anemije ( test je pozitivan samo na C3), sa autoimunom hemolitičkom anemijom uzrokovanom antitijelima na hladno - bolest hladnog aglutinina (test je pozitivan samo na C3). Kod paroksizmalne hladne hemoglobinurije, direktni Coombsov test je negativan.
U akutnom periodu bolesti, zbog razaranja eritrocita, na kojima je fiksiran veliki broj antitela, tokom hemolitičke krize, kao i kod nedovoljne količine antitela u hroničnom toku bolesti, negativan direktan Može se primijetiti Coombsov test.
| : | ||
|---|---|---|
- Važan uslov za osiguranje kvaliteta laboratorijska istraživanja krv se uzima na prazan želudac, ujutro (prije 12:00).
- 12 sati prije studije trebali biste isključiti alkohol, pušenje, jesti, ograničiti fizičku aktivnost.
- Ujutro na dan uzimanja uzoraka krvi za istraživanje, možete piti vodu.
- Isključiti lijekove; ako nije moguće otkazati lijek, o tome se mora obavijestiti laboratorija.
- Materijal je poželjno uzeti prije bilo kakvih medicinskih dijagnostičkih manipulacija.
- Prilikom procjene nivoa hormona kod žena, važno je uzeti u obzir dan menstrualnog ciklusa kada je najbolje otkriti određene hormone. Ove informacije možete dobiti od svog ljekara.
| Indeks | Karakteristično |
|---|---|
| Analizator i sistem za testiranje | Gel kartice; DiaMed AG (Švicarska) |
| Referentne vrijednosti | Negativan rezultat / Pozitivan rezultat |
| ometajući faktori. Lijekovi | |
| Pozitivan test je moguć kada se uzimaju sljedeći lijekovi: acetaminofen, salicilna kiselina, aminopirin, antihistaminici, karbromal, cefalosporini, hlorpromazin, hlorpropamid, cisplatin, klonidin, dipiron, etosuksimid, fenfluramin, fuadin, hidralazin, hidrohlorotiazid, ibuprofen, insulin, melosporina, izoniazid, metilserdo, levodopa, penicilamin, penicilini, fenacetin, fenilbutazon, probenecid, prokainamid, kinidin, kinin, rifampin, streptomicin, sulfonamidi, derivati sulfonilureje, tetraciklin, triamteren, trimelitski anhidrid | |
| Indikacije za termin | |
|
|
| Interpretacija rezultata | |
|
Normalno, direktni Coombsov test je negativan. Pozitivan Coombs test za:
|
|
