Kas ir PCR pētījums. Kā savākt biomateriālu diagnostikai

Ph.D. Pokrovska M.S.,
atbilstošais loceklis RAMN, prof. Smirnovs G.B.
(NIEM nosaukts Krievijas Medicīnas zinātņu akadēmijas N. F. Gamaleja un AS "LAGIS" vārdā)

Ievads

Jau sen ir zināms, ka, lai izārstētu pacientu, ir jāzina, ar ko tieši viņš slimo. Slimības veida noteikšanas procesu sauc par diagnozi. Jebkuras slimības diagnozi veic ārsts (pamatojoties uz anamnēzes izpēti, novērojumiem klīniskās izpausmes un datu analīze laboratorijas pētījumi), pēc tam viņš izraksta ārstēšanu. Mūsdienās, nosakot diagnozi, ārsts izmanto laboratorijas datus, bez kuriem ir vai nu grūti, vai atsevišķos gadījumos neiespējami noteikt pareizu diagnozi.

Diagnozes kā slimības atpazīšanas procesa nozīme ir tajā, ka agrīna, precīza diagnoze ir pamats racionālai un efektīva terapija, ļauj vairumā gadījumu paredzēt iespējamie varianti turpmākā slimības gaita un iznākums.

Infekcijas slimību diagnostikā, t.sk. STS ir svarīgi identificēt etioloģiskais faktors(izraisītājviela) un noteikt slimības stadiju, tas ir, iegūt informāciju, kas nepieciešama etiotropās un adekvātas terapijas izvēlei, prognozēt slimības gaitu un tās pabeigšanas laiku.

Mūsdienu laboratoriskās diagnostikas raksturīgās iezīmes ir nepārtraukta jaunu izstrāde un zināmu metožu un paņēmienu pilnveidošana. Tas ir saistīts ar faktu, ka pēdējo desmitgažu laikā ir notikušas nepārtrauktas izmaiņas, kā klīniskā aina infekcijas slimības un to patoģenēzes pazīmes. Piemēram, labi zināmi diezgan bīstami patogēni var izraisīt izdzēstas slimību formas vai otrādi: oportūnistiski vai nepatogēni mikroorganismi izraisa smagas formas. Patogēno mikroorganismu tropisms mainās (tie ietekmē citus orgānus un audus), un rezultātā parādās jaunas infekcijas procesu formas. Rodas hroniskas, noturīgas infekciju formas un mainās patogēnu antigēnā struktūra, mikroorganismi pāriet nekultivētā stāvoklī. Novirzes no klasiskajām infekcijas slimību gaitas formām un netipisku formu rašanās ir saistītas ar diviem apstākļiem. Pirmkārt, daļai iedzīvotāju ir mainījies imūnsistēmas stāvoklis, kļuvuši izplatīti dažāda rakstura imūndeficīta stāvokļi. Otrkārt, mainās paši patogēni. Tas ir, mēs esam liecinieki evolūcijas procesam mikroorganismos.

Tas viss sarežģī diagnozi un negatīvi ietekmē ārstēšanas efektivitāti. Lietošanas loma modernas metodes laboratoriskie pētījumi diagnostikai tagad kļūst ļoti nozīmīgi.

Infekcijas slimību diagnosticēšanai tiek izmantotas dažādas laboratoriskās un instrumentālās metodes, starp kurām svarīgāko vietu ieņem specifiskas metodes, kuru mērķis ir identificēt slimības izraisītāju un tādējādi noteikt etioloģisko diagnozi.

Šī paziņojuma tēma ir atlasītas infekcijas slimību laboratoriskās diagnostikas sadaļas.

Infekciju laboratoriskās diagnostikas pamatjēdzieni un metodes

Laboratoriskās diagnostikas galvenie rādītāji ir infekcijas izraisītāju (sēnīšu, vienšūņu, baktēriju un vīrusu) noteikšanas metožu jutīgums un specifika.

• Jutīgums-Šo minimālā summa materiāls, ko var noteikt ar šo metodi. Materiāls var būt veseli mikroorganismi un patogēnu molekulu fragmenti, kā arī specifiskas antivielas, ko cilvēka ķermenis ražo, reaģējot uz infekciju. Jo mazāk materiālu var atklāt metode, jo augstāka ir tās jutība. Ja laboratorijas pētījumā netiek atklāti mikroorganismi, kas atrodas paraugā un kuru noteikšanai ir izstrādāta pārbaudes sistēma, rezultātu sauc par viltus negatīvu. Jo augstāka ir metodes jutība, jo mazāk viltus negatīvu [viltus (-)] rezultātu.
• Specifiskums- tā ir metodes spēja norādīt uz paraugā tikai tā objekta klātbūtni, kura noteikšanai tika izstrādāta testa sistēma. Ja metode norāda uz tādu mikroorganismu klātbūtni paraugā, kas tajā nav ietverti, rezultātu sauc par viltus pozitīvu. Jo augstāka ir metodes specifika, jo mazāk viltus pozitīvu [viltus (+)] rezultātu.

  Visas laboratoriskās diagnostikas metodes var iedalīt divās grupās: tiešās un netiešās mikroorganismu noteikšanas metodes.

• Tiešās metodes Tā nosaukta, jo tie tieši atklāj infekcijas izraisītājus vai materiālu, kas ir daļa no patogēna vai ko tas ražo. Parasti tie ir antigēni vai ģenētiskais materiāls. Tiešās metodes ietver šādas (1. tabula):

  1. tabula. Laboratoriskās diagnostikas tiešās metodes
  Metodes	Metodes princips	Specifiskums	Jutīgums
  Mikrobioloģiskais	Patogēna tīrkultūras izolēšana	100% laboratoriskās diagnostikas "zelta standarts".	1000-10000 šūnas/ml
  Citoloģiskā (mikroskopija)	Iekrāsoto uztriepes pārbaude	20-80%	1000-100000 šūnas/ml
  Imunocitoloģiskā un seroloģiskā	Antigēnu noteikšana pēc saistīšanās ar antivielām RIF, ELISA	70-90%	1000-100000 šūnas/ml
  Molekulāri bioloģiskā	Specifiska DNS/RNS reģiona noteikšana patogēna genomā	99-100% atbilst "zelta standartam"	200 šūnas/ml (1 šūna katrā reakcijā)

  Nepatiesi (+) rezultāti citoloģiskās metodes gadījumā ir saistīti ar rezultātu novērtējuma subjektivitāti, imunoloģisko metožu gadījumā - ar antigēnu krustenisko reakciju ar antivielām.

  Nepatiesi (-) rezultāti tiešajās metodēs var būt saistīti ar patogēna nepieejamību klīniskā materiāla paraugu ņemšanas laikā, mikrobioloģiskajai metodei - mikroorganisma nāve parauga transportēšanas laikā un nekultivējamas formas gadījumā. .

• Netiešās metodesšādi nosaukti, jo tie atklāj nevis pašu patogēnu, bet gan specifiskas antivielas, ko cilvēks ražo, reaģējot uz šāda veida infekciju, t.i. ir imunoloģiski. Šīs metodes ietver: komplementa saistīšanas reakciju (RCC), netiešo imūnfluorescences reakciju (RNIF), mikroimunofluorescences reakciju (MIF), rekombinanto lipopolisaharīdu ELISA (r - ELISA), enzīmu imūntestu (ELISA). Šo metožu jutība ir 1000-100000 šūnas/ml.

  Lietojot imunoloģiskās metodes, gandrīz visos gadījumos viltus (+) rezultāti ir saistīti ar nespecifisku antivielu saistīšanos ar antigēniem vai antigēnu krustenisku reakciju ar antivielām. Nepareizi (-) rezultāti rodas nepietiekama specifisko antivielu vai antigēnu daudzuma paraugā un nepietiekamas noteikšanas metožu jutības dēļ.

  Neskatoties uz ievērojamiem sasniegumiem mūsdienu laboratorijas diagnostika neviena metode praksē negarantē 100% jutīguma un specifiskuma kombināciju. Tātad tas nedod 100% pareizu atbildi. Tāpēc, lai noteiktu diagnozi, ārstam bieži ir jāizmanto vismaz divi atšķirīga metode, un katru pētījumu vislabāk veikt divos vai trīs atkārtojumos. Tā ir prasība, lai diagnosticētu tādas slimības kā tuberkuloze, hlamīdijas un vairākas citas (1).

A, M, G klases imūnglobulīnu noteikšanas diagnostiskā vērtība

Sīkāk pakavēsimies pie seroloģiskās diagnostikas (antivielu noteikšana asins serumā ar ELISA palīdzību). Tas ir balstīts uz ļoti specifisku antivielu (AT) noteikšanu, kas veidojas cilvēka organismā, reaģējot uz infekciozu mikroorganismu klātbūtni. Šīs antivielas ir M, A, G klases imūnglobulīni (Ig). Antivielas neitralizē infekcijas izraisītājus, mijiedarbojoties ar antigēniem. Antigēns ir specifiska infekcijas izraisītāja (mikroorganisma) daļa, kas izraisa specifisku antivielu veidošanos cilvēka organismā (imūnreakcija). Seroloģisko reakciju pamatā ir specifiska antigēna un antivielu mijiedarbība. Apskatīsim, ko diagnozes noteikšanai dod IgM, IgA, IgG klases antivielu noteikšana (2. tabula).

2. tabula. Infekcijas slimības stadijas noteikšana, pamatojoties uz antivielu pētījuma rezultātiem asins serumā ar ELISA metodi
Slimības stadija (forma).	Antivielas to parādīšanās secībā serumā	Titru dinamika (2-3 nedēļu diapazonā)
Akūts ar primāro infekciju	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA vai - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ agrīna vai agrīna agrīna IgG	Titru palielināšanās vai samazināšanās (IgM pēc 7. dienas) atkarībā no laika, kas pagājis kopš infekcijas sākuma
Sekundārā infekcija un reaktivācija (recidīvs)	IgG ⇒ IgA, gandrīz nav IgM ⇒ agrīna vai agrīna agrīna IgG	Straujš titru pieaugums vai kritums
Hronisks	IgG ⇒ IgA, dažreiz tikai IgA vai tikai IgG	Pastāvīgi zemi titri, var būt pastāvīgi augsti - smagas augšupejošas infekcijas vai sistēmisku bojājumu gadījumā.
neatlaidība, pārvadāšana	IgA vai IgG	Pastāvīgi (vairākas nedēļas) zemi titri (antivielas ne vienmēr tiek noteiktas mikroorganismu izmainītās antigēnās struktūras dēļ)
ilgstoša slimība	IgG	Pastāvīgi zemi titri

Dažādu klašu antivielu kvantitatīvā noteikšana palīdz noteikt slimības gaitas stadiju un raksturu. Interpretējot kvantitatīvos rezultātus, jāņem vērā, ka imūnā atbilde cilvēka ķermenis infekcijas attīstība un tās radīto antivielu līmenis ir atkarīgs no patogēnu īpašībām, stadijas infekcijas process un imūnsistēmas individuālās īpašības. Smagas imūnsupresijas gadījumā AT sintēzi var pilnībā nomākt. Tāpēc, lai noteiktu diagnozi, īpaši netipiskās infekciju formās, ārsts nevar viennozīmīgi interpretēt viena pētījuma kvantitatīvo rezultātu.

Lai pareizi novērtētu dažādu infekcijas izraisītāju antivielu kvantitatīvās noteikšanas rezultātus, nepieciešams izmantot pāru serumu principu (atkārtot pētījumu pēc 2-3 nedēļām un salīdzināt rezultātus). Šādi pētījumi ļauj analizēt antivielu noteikšanas dinamiku un tādējādi iegūt nepieciešamo informāciju par infekcijas procesa attīstību. Četrkārtīgs antivielu pieaugums 2-3 nedēļu laikā norāda uz infekcijas attīstību.

Tieši tāpēc, lai varētu veikt šādus pāru pētījumus, ir nepieciešami kvantitatīvi ELISA rezultāti.

Tradicionālais definēšanas veids akūta infekcija- IgM noteikšana asins serumā. Mūsdienu diagnostikas testu sistēmas ļauj papildus IgM noteikt arī citas agrīnas antivielas, piemēram: 1) IgG pret tūlītējiem agrīniem vīrusu proteīniem un 2) zemu avid IgG. Turklāt IgG uz agrīniem vīrusu proteīniem ir gan primārās akūtas infekcijas, gan recidīva (hroniskas infekcijas saasināšanās) un atkārtotas inficēšanās marķieri, t.i. visi akūtās infekcijas varianti, atšķirībā no IgM, kas parasti tiek ražoti tikai primārās infekcijas laikā.

polimerāzes ķēdes reakcija

Molekulārās diagnostikas metožu ieviešana medicīniskās mikrobioloģijas praksē, protams, bija nozīmīgs notikums, kas radikāli paplašināja slimību patoģenēzes izpētes iespējas, fundamentāli uzlaboja diagnostiku un pat iezīmēja jaunas pieejas ārstēšanā. Arvien biežāk tiek izmantota uz PCR balstīta molekulārās diagnostikas metode, kas nodrošina optimālu augstas jutības un specifiskuma kombināciju.

Molekulārā diagnostika kopumā un jo īpaši PCR balstās uz specifisku nukleīnskābju klātbūtnes noteikšanu testa paraugā, visbiežāk DNS.

DNS ir divpavedienu (divpavedienu) polimēra molekula, kuras nukleotīdu secība nosaka visas organisma īpašības. Kad šūnas dalās, DNS tiek dubultota, un katra no divām meitas šūnām saņem precīzu mātes šūnas ģenētiskā materiāla kopiju. DNS molekulas dublēšanos sauc par replikāciju. Uz divām sākotnējām (matricas) DNS ķēdēm tiek veidotas jaunas meitas ķēdes (papildina matricu). Replikāciju nodrošina enzīmu komplekss, kura galvenais elements ir DNS polimerāze. Lai DNS polimerāze varētu uzsākt replikāciju, tai papildus veidnei ir nepieciešams praimeris (praimers) - neliels DNS fragments, kas komplementāri saistīts ar šablonu. DNS polimerāze it kā pagarina šo sēklu, izveidojot jaunu DNS ķēdi uz esošās veidnes. Parasti visa DNS šūnā vai vīrusā replikējas dabā, un šī procesa produkts ir divas identiskas sākotnējās DNS kopijas.

Tagad, kad esam īsi atcerējušies vissvarīgāko par replikāciju, mēs varam pāriet uz polimerāzes ķēdes reakcijas aprakstu. PCR tika atklāts 1983. gadā, un šobrīd to plaši izmanto zinātniskiem un praktiskiem pētījumiem infekcijas un ģenētisko slimību diagnostikas jomā, agrīna diagnostika dažas onkoloģiskās patoloģijas. Par šīs metodes atklāšanu Kerija Mullisa 1995. gadā tika apbalvota ar prestižāko zinātnisko balvu - Nobela prēmiju.

Šīs reakcijas laikā notiek arī DNS replikācija, bet ne parastajā veidā dabā. Pirmkārt, tiek replicēta ne visa mikroorganisma DNS, bet tikai neliels tās fragments (mērķis).

Otrkārt, PCR produkts ir nevis divas, bet miljoniem sākotnējā mērķa kopiju. Šo atkārtoto replikāciju sauc par pastiprināšanu.

Dažādām baktēriju ģintīm un sugām, kā arī vīrusiem ir dažādi ģenētiskie teksti (DNS nukleotīdu sekvences). Mūsdienu datorprogrammas satur dažādu organismu atšifrētu DNS sekvenču datubāzi. Izstrādājot diagnostisko PCR testa sistēmu, tiek atrasts neliels DNS fragments (mērķis), kas ir stingri specifisks konkrētam patogēnam. Tieši šis reģions tiek pastiprināts ar PCR, un pēc tam amplifikācijas produkts (amplikons) tiek identificēts ar agarozes gēla elektroforēzi.

Identificējot konkrētam mikroorganismam raksturīgu DNS fragmentu, mikroorganisms tiek noteikts.

Katrs infekciju diagnostikas cikls notiek trīs posmos (att.):

1. Denaturācija - divpavedienu DNS ķēžu attīšana - nav fermentatīvs process, kas notiek 95 0 C temperatūrā.
2. Gruntējumu piestiprināšana (atkausēšana). Replikācijas procesa uzsākšanai PCR izmanto praimerus - īsu vienpavediena DNS (15-30 bāzes gara), ko liekā veidā pievieno reakcijas maisījumam. Tie īpaši (saskaņā ar komplementāras savienošanas principu) pievienojas īsām sadaļām, kas ierobežo izvēlēto mērķi. Šis posms nav fermentatīvs un notiek reakcijas maisījuma inkubācijas laikā 55-65 0 C temperatūrā. Praimeri tiek piesaistīti tikai atlasītiem DNS fragmentiem, kas ir specifiski šim patogēnam un nesadarbojas ar citām DNS sekvencēm un dažādiem mikroorganismiem). Tas nodrošina diagnostiskās PCR pārbaudes sistēmas absolūto specifiku. Pārmērīgs DNS praimeru daudzums attiecībā pret šablona DNS nodrošina augstu metodes jutīgumu. Tas nozīmē, ka sākotnējā PCR šķīdumā esošie praimeri ar 100% varbūtību atradīs piesaistes mērķi.
3. Praimeru pievienošanas rezultātā veidojas struktūras [DNS šablons + primer], kas ir "sēklu" kompleksi. Primeru pabeigšana sākas, sākot no 3'-galiem, ar komplementāru sintēzi uz vienpavedienu DNS fragmentu veidnēm. Šis process tiek veikts ar īpaša enzīma - Taq polimerāzes (termostabila DNS polimerāzes) un nukleotīdu (kā būvmateriāla) palīdzību.

   Tikko sintezētā divpavedienu DNS pēc denaturācijas posma atkal saista primerus, kas maisījumā ir pārāk daudz. Iegūtās struktūras pēc pabeigšanas veido specifiskus DNS fragmentus, ko ierobežo praimeru sekvences. Tādējādi, pat ja tikai viena DNS molekula bija sākotnējā PCR, tad amplifikācija notiek 25–40 ciklos, t.i. sintezēts liels skaits(108-109 kopijas) specifisku DNS fragmentu (amplikonu), kas ir pietiekami, lai vizuāli reģistrētu reakcijas rezultātu pēc elektroforēzes agarozes gēlā.

PCR veic ciklatorā vai riteņbraucējs- ierīce, kurā noteiktais temperatūras maiņas režīms tiek automātiski veikts cikliski, ļaujot atkārtoti secīgi iziet 1, 2, 3 posmus.

Reakcijas uzskaiti veic, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi. Negatīvi lādētas DNS molekulas pārvietojas gēlā elektriskā lauka iedarbībā no katoda uz anodu, savukārt DNS fragmentu darbības ilgums noteiktā laika periodā ir atkarīgs no to lieluma. Gēlā esošā DNS ir iekrāsota ar etīdija bromīdu, padarot to redzamu ultravioletajā gaismā. Ja PCR rezultātā testa paraugā ir uzkrājušies amplikoni (vienāda izmēra DNS fragmenti), tad tie būs vienādā attālumā no sākuma un būs redzami kā josla uz gēla trases. Ja joslas novietojums uz gēla sliežu ceļa atbilst aprēķinātajam izmantotajam gruntējuma pārim, t.i. atrodas tādā pašā attālumā no sākuma kā pozitīvās kontroles josla, tas nozīmē, ka pētījuma rezultāts ir pozitīvs.

Tāpat kā katrā eksperimentā, ņemot vērā PCR rezultātus, tiek nodrošinātas kontroles - pozitīvas un negatīvas. Jebkurai diagnostikas pārbaudes sistēmai ir jābūt apstiprinātam regulējumam, kas ietver minēto kontrolierīču klātbūtni.

Pozitīva kontrole ir paraugs ar DNS veidni konkrēta amplikona uzkrāšanai, kas atbilst noteiktajam mikroorganismam.

Negatīvā kontrole - ūdens, cilvēka DNS vai mikroorganismu DNS, kas ir cieši saistīti ar to, ko nosaka šī testa sistēma.

PCR metodes priekšrocības

PCR diagnostika ir viena no modernākajām un progresīvākajām laboratoriskās diagnostikas metodēm, kas ļauj specifiski noteikt infekcijas slimību patogēnu atsevišķu šūnu DNS paraugā.

Pastāv būtiska atšķirība starp molekulārās diagnostikas metodēm, tostarp PCR, un citām tradicionālām metodēm. Šī atšķirība ir tāda tradicionālās metodes atklāj mikroorganismu gēnu darbības produktus (olbaltumvielas, antigēnus un sarežģītāk sakārtotās pazīmes), savukārt PCR tieši atklāj ģenētisko materiālu. Tādējādi mikroorganisms tiek atklāts ar PCR, neatkarīgi no genoma funkcionēšanas iezīmēm, jebkādām netipiskām izpausmēm.

Var teikt, ka PCR sasniedz maksimālo iespējamo jutību. PCR testa sistēmu jutība ir 10-1000 šūnas uz vienu paraugu, savukārt imunoloģiskās un mikroskopiskās metodes jutība ir 1000-100000 šūnas uz paraugu. Pateicoties augstajai jutībai, uz PCR balstītas testa sistēmas ir neaizstājamas gadījumos, kad pētāmais materiāls (izraisītājs) ir ļoti mazs.

Pateicoties augstajai jutībai, PCR tests ļauj agrīni diagnosticēt slimības (piemēram, laikā profilaktiskās apskates iedzīvotāju), precizēt diagnozi uz antibiotiku terapijas fona, pārbaudīt izārstēšanu (ārstēšanas efektivitāti), kā arī atklāt noturīgus mikroorganismus. Dažiem patogēniem, piemēram, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, diagnostisko PCR testu sistēmu jutība nedrīkst būt augsta. Jutības indikatori ir īpaši izstrādāti un apstiprināti, sākot no 105-6 šūnām uz ml. Šādas testa sistēmas atklāj diagnostiski nozīmīgu šo mikroorganismu skaitu (2,3).

Grūti kultivētu, nekultivējamu un noturīgu patogēno mikroorganismu formu noteikšanā nepieciešamo diagnostisko atbildi sniedz tikai tieša metode, kas nosaka patogēna DNS. Citas diagnostikas metodes (imunoloģiskās, bakterioloģiskās, mikroskopiskās) ir sarežģītas vai pat neiespējamas. Noturīgu mikroorganismu gadījumā tas var būt saistīts ar izmaiņām patogēnu antigēnajā struktūrā vai šādu mikroorganismu pāreju uz nekultivētu formu. Tas ir jāatceras, diagnosticējot latentas un hroniskas infekcijas.

PCR metodes augsto specifiku nosaka praimeru nukleotīdu secība un nosacījumi to piesaistei konkrētam DNS fragmentam (mērķim) stingri šim patogēnam. Atkarībā no izvēlētajiem praimeriem PCR testa sistēma var atšķirt vienas sugas mikroorganismu ģintis, sugas, serotipus un pat patogēnos un nepatogēnos celmus.

Izmantojot PCR infekciju diagnosticēšanai, ir iespējams noteikt patogēnu jutību (vai rezistenci) pret daudzām izmantotajām antibiotikām. Īpaši tas attiecas uz gadījumiem, kad mikrobioloģisko pētījumu metodi nevar pielietot.

PCR analīzei ir piemērots jebkurš klīniskais materiāls, kas potenciāli satur infekcijas izraisītājus – asinis, serums, skalošanas šķidrums, krēpas, siekalas, kuņģa sula, biopsijas materiāls, uztriepes, mazgāšanas līdzekļi. Pētītais materiāls var būt paraugi no vides objektiem (izskalojumi, nospiedumi, uztriepes, ūdens, augsne u.c.).

PCR ir vienota un automatizēta metode, kas pieļauj standarta atbilstību šīs PCR pārbaudes sistēmas lietošanas atļaujās apstiprinātajiem noteikumiem un nodrošina augstu rezultātu precizitāti un reproducējamību.

Laboratoriskā diagnostika ar PCR - ātri un uzticams veids infekcijas slimību patogēnu noteikšana. PCR laboratorija sniedz atbildi 48 stundu laikā no brīža, kad materiāls tiek nogādāts pētījumā. (Katra parauga neto pārbaudes laiks ir tikai dažas stundas.)

Vienā klīniskajā paraugā vienlaikus var noteikt vairāk nekā 20 patogēnus.

Svarīgs aspekts, veicot klīniskā parauga izpēti, ir atbilstība klīniskā materiāla savākšanas un uzglabāšanas noteikumi. Šeit ir tikai daži vispārīgi ieteikumi:

• Klīniskā materiāla paraugu ņemšana tiek veikta no paredzamās mikroorganismu dzīvotnes un infekcijas attīstības (lai to izdarītu, ir jāņem vērā ieejas vārti, izplatīšanas ceļi, vairošanās vietas un vēlamo mikroorganismu izolācijas veidi).
• Izplūdes daudzumam paņemtajā materiālā jābūt mazam (ne vairāk kā “sērkociņa galviņas izmēram”). Pārmērīga izdalīšanās, gļotas un strutas nelabvēlīgi ietekmē DNS ekstrakcijas kvalitāti un veicina DNS degradāciju uzglabāšanas un transportēšanas laikā.
• Klīniskā materiāla paraugu ņemšanai ir nepieciešams izmantot tikai vienreizējās lietošanas otas vai tamponus. Ievadot klīnisko materiālu laboratorijas mēģenē ar šķīdumu, ievērojiet sterilitāti.

Molekulārās diagnostikas nozīme

Viens no spilgtākajiem piemēriem, kas parāda molekulārās diagnostikas nozīmi, ir augsta onkogēna riska papilomas vīrusa infekcijas atklāšana. Ne visi papilomas vīrusi izraisa ļaundabīgu augšanu. Ir vīrusu genotipi, kas, visticamāk, izraisa vēzi, un tā sauktie labdabīgie genotipi. Pirmie ietver genotipus 16, 18 (izplatīti mūsu reģionā), 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 ( P291) un MM9 (P238A). 6., 11., 40., 42., 53., 54., 57., 66. un MM8 (P155) genotipi tiek uzskatīti par labdabīgiem. Ir iespējama papilomas vīrusa genotipa identificēšana, un to veic, izmantojot PCR (4,5).

Papilomas vīrusa tipi 16,18 saglabājas dzemdes kakla plakanā epitēlija šūnās, neizraisot klīniskas izpausmes gadiem (līdz 5 gadiem). inkubācijas periods), līdz veidojas pamanāma neoplāzija. Savlaicīga diagnostika šādos gadījumos ir iespējama tikai ar iedzīvotāju profilaktiskām apskatēm, izmantojot PCR. Ja tiek konstatēta tādu papilomas vīrusa tipu DNS, kas var izraisīt vēzi, pacientam jākonsultējas ar onkologu, jāapmeklē viņš reizi mēnesī, jāuzrauga klīniskās izpausmes. Tādējādi PCR šajā gadījumā ļauj veikt agrīnu diagnostiku, kas ļauj novērst vai nesākt dzemdes kakla vēzi.

Vairākos gadījumos noteiktos slimības posmos patogēnus nevar izolēt ar klasiskām mikrobioloģiskām metodēm. Tas ir saistīts ar faktu, ka mikroorganismi var atrasties iekšpusē epitēlija šūnas, audos vai gļotās (piemēram, hlamīdijām, mikoplazmām, ureaplazmām visiem vīrusiem ir raksturīga intracelulāra lokalizācija, un Trichomonas un gonokoki var būt gan intracelulāri, gan ārpusšūnu). Turklāt dažas baktērijas noteiktu faktoru ietekmē var nonākt tā sauktajās nekultivējamās formās vai nekultivētā stāvoklī. Piemērs ir hlamīdiju zinātniskais un medicīniskais pētījums. Chlamydia trachomatis noteikšanas ilgums infekcijas fokusā tika salīdzināts, izmantojot audu kultūras metodes, tiešo fluorescenci, PCR (DNS noteikšana) un Western blot (RNS noteikšana). Konstatēts, ka nukleīnskābju noteikšanas metodes fokusā patogēnu atklāj 4 nedēļas ilgāk (16 nedēļas pret 12 nedēļām pēc primārās infekcijas) nekā tradicionālās metodes. Šajā darbā tika izdarīts secinājums par hlamīdiju pārejas iespējamību infekcijas procesa laikā uz nekultivētu stāvokli. Šādā stāvoklī hlamīdijas turpina izraisīt iekaisumu vai saglabājas epitēlija šūnās, bet mikrobioloģija tās nenosaka (6).

Šobrīd ir uzkrāts ļoti liels materiālu apjoms, kas liecina par molekulārās diagnostikas aktualitāti, taču citus piemērus nevaram izskatīt šīs publikācijas ierobežotā apjoma dēļ.

Laboratoriskās diagnostikas metožu izmantošanas stratēģija

Pašreizējā infekcijas slimību laboratoriskās diagnostikas attīstības stadijā ir acīmredzama nepieciešamība pēc integrētas pieejas, kas sastāv no dažādu laboratorijas metožu izmantošanas, lai noteiktu infekcijas slimības etioloģisko diagnozi. Par vienas vai otras laboratorisko pētījumu metodes izmantošanu ārsts lemj pēc anamnēzes un klīnisko izpausmju izpētes. Tiek izmantotas dažādas metožu kombinācijas atkarībā no patogēnu bioloģijas īpašībām un to mijiedarbības ar imūnsistēma persona, kā arī slimības forma.

Piemēram, hlamīdiju, herpes grupas vīrusu, toksoplazmas laboratoriskai diagnostikai tiek analizēti PCR un ELISA pētījumu rezultāti. Un mikoplazmozes un ureaplazmozes laboratoriskajā diagnostikā tiek izmantota PCR kombinācija ar kultūru izolāciju, nosakot jutību pret antibiotikām. Lai identificētu nespecifisku oportūnistisku mikrofloru, tiek izmantota uztriepes mikroskopija un kultūras izolēšanas mikrobioloģiskā metode.

Klīnicists veic diagnozi, pamatojoties uz pacienta vēstures, klīnisko izpausmju un laboratorijas diagnostikas datu izpēti.

Literatūra:

• Seksuāli transmisīvās infekcijas, Nr. 2, 21.-24. lpp., 2002. Uroģenitālā hlamīdiju infekcija. Pieejas diagnostikai un terapijai. G.A. Dmitrijevs, TsNIKVI Krievijas Federācijas Veselības ministrija, Maskava.
• Apmācība. Viskrievijas izglītojošais, zinātniskais un metodiskais nepārtrauktās medicīniskās un farmaceitiskās izglītības centrs. Maskava, 1999. Maksts mikroekoloģija. Mikrofloras korekcija maksts disbakteriozes gadījumā. V.M. Koršunovs, ... L.I. Kafarskaja, ... V.V. Smejanovs. Krievijas Federācijas Veselības ministrija, Krievijas Valsts medicīnas universitāte, MIMSR, RMAPO, Maskava.
• Seksuāli transmisīvās infekcijas, Nr. 1, 8.-15. lpp., 2002. Pašreizējais stāvoklis jautājumā par Ureaplasma urealiticum nozīmi uroģenitālo slimību ģenēzē. UN. Kisina, O.S. Zagrebina, K.I. Zabirovs, V.V. Meškovs. Krievijas Federācijas Veselības ministrijas TsNIKVI, Veselības ministrijas pilsētas klīniskā slimnīca Nr.47, Maskava.
• Kanceroģenēze. Autoru komanda, ko rediģēja D.G. Zaridze. Zinātniskā pasaule, 2000, Maskava. Papilomas vīrusi un to loma dzemdes kakla kanceroģenēzē. F.L. Kiseļevs. Krievijas Medicīnas zinātņu akadēmijas Vēža pētniecības centrs.
• Medicīnas laboratorijas diagnostika(programmas un algoritmi). Rokasgrāmata, kuras redaktors ir prof.A.I. Karpiščenko, 2001, Intermedica, Sanktpēterburga.
• Inficēt. Immun., 1992. gada maijs, 2040-2047, 60. sēj., Nr. 5. Hlamīdiju RNS un DNS demonstrēšana kultūras negatīvā stāvoklī. SM Holande, …HR Teilore. Infekcijas slimību nodaļa, Džona Hopkinsa slimnīca, Baltimora, Merilenda.

Arvien biežāk medicīnas praksē sāka lietot jauna metode infekcijas slimību diagnostika, kam ir saīsinājums PCR. Kāda ir šīs pētījuma metodes būtība un kādas slimības ar to var atklāt, kā arī kādas ir PCR priekšrocības salīdzinājumā ar citām izplatītām diagnostikas metodēm un kā pareizi sagatavoties analīzei, varat uzzināt, izlasot šo rakstu. .

Kas ir PCR?

Saīsinājums PCR apzīmē polimerāzes ķēdes reakciju. Tā ir DNS segmenta spēja proporcionāli vairoties, kad nepieciešamie nosacījumi. Infekciju PCR diagnostika tika izgudrota pagājušā gadsimta astoņdesmitajos gados. Pie atklājuma strādāja Eiropas, Amerikas un padomju zinātnieki, tāpēc nav iespējams noteikt novatoriskās diagnostikas metodes aizsācēju. Turklāt kopš 1983. gada, kad oficiāli tika reģistrēta tāda infekcijas slimību izpētes metode kā PCR, turpinās darbs pie šīs metodes uzlabošanas. Šodien šī diagnostikas metode tiek izmantota gandrīz katrā medicīnas laboratorijā, kurā ir nepieciešamā modernā iekārta.

Kā tiek veikta analīze?

PCR analīzei atkarībā no medicīniskās indikācijas, ir nepieciešams veikt medicīnisku paraugu ņemšanu no tādiem materiāliem kā asinis, siekalas, urīns, sperma, mātes piens vai dzimumorgānu sekrēti, epitēlija šūnas. Infekciju diagnostika, izmantojot PCR, ir patogēna DNS noteikšana testa materiālā. Ar īpašu laboratorijas manipulāciju palīdzību, izmantojot ķīmiskos reaģentus un aprīkojumu, laboranti veic polimerāzes ķēdes reakciju. Ar tās palīdzību mikroskopā neredzamā patogēna DNS daļa izaug līdz ierīcē pamanāmiem izmēriem. Tāpēc ir iespējams noteikt infekcijas izraisītāju pat tad, ja testa materiālā ir nenozīmīga tā DNS daļa.

Kādas infekcijas var noteikt ar PCR?

Spēj atklāt vairākus patogēnos mikroorganismus Infekciju PCR diagnostika. Rezultātu interpretācija ir samazināta līdz patogēna noteikšanai un tā veida noteikšanai. Lai diagnosticētu, tiek izmantota polimerāzes ķēdes reakcija dažādas slimības cilvēks: no seksuāli transmisīvām līdz asimptomātiskām, t.s slēptās infekcijas. PCR atklāj:

• hepatīta vīruss (A, B, C);
• ureplasma urealiticum;
• ureplasma parvum;
• hlamīdijas trachomatis;
• Candida
• mikoplazmas hominis;
• genitalija mikoplazma;
• garganella vaginalis;
• trichomoniāze;
• mikobaktērijas tuberkuloze;
• 1. un 2. tipa herpes simplex vīruss;
• papilomas vīruss;
• Epshetaina-Barra vīruss;
• helicobacter pylori;
• imūndeficīta vīruss.

Iepriekš minētie mikroorganismi izraisa tādas slimības kā hepatīts, tuberkuloze, STI un AIDS.

Infekciju PCR diagnostika tiek veikta kvalitatīvas (tas ir, tiek noteikta patogēna klātbūtne vai neesamība) un kvantitatīvās analīzes veidā (tiek aprēķināts mikrobu skaits organismā - šī pieeja ir nepieciešama, piemēram, HIV infekciju un hepatīta diagnostikā).

Diagnostikas metodes priekšrocības

Gandrīz katra laboratorija mūsdienās diagnosticē cilvēka infekcijas, izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju. Kādas ir šīs metodes priekšrocības, kāpēc tā tik īsā laika periodā kļuvusi neticami populāra gan mediķu, gan pacientu vidū? Tik strauja inovatīvu tehnoloģiju izplatība ir izskaidrojama ar augstu uzticamības, efektivitātes un jutīguma līmeni. Ļaujiet mums sīkāk apsvērt PCR diagnostikas metodes priekšrocības:

1. Analīzes process ir maksimāli automatizēts, kas izslēdz cilvēcisko faktoru rezultāta izpētes un interpretācijas laikā.
2. Pateicoties modernās tehnoloģijas kultūras tiek audzētas 4-6 stundu laikā, un attiecīgi jūs varat iegūt analīzes rezultātu dienā, kad materiāls tiek nodots izpētei.
3. Infekciju PCR diagnostika ir ļoti jutīga, kas ļauj noteikt patogēnu pat neliela DNS fragmenta klātbūtnē. Dažos gadījumos, piemēram, ar gausām un asimptomātiskām slimībām, kultūraugu sēšana ar citu metodi ir sarežģīta vai pilnīgi neiespējama.
4. PCR izpētes materiāls var būt asinis, siekalas, uroģenitālās sekrēcijas, epitēlija šūnas, urīns, sperma, kas ir ļoti ērti, ja nav iespējams paņemt noteiktu materiālu analīzei. Infekcijas slimību diagnostikai parasti izmanto venozās asinis un uroģenitālo uztriepi.
5. Polimerāzes ķēdes reakcijas metode var identificēt vairākus patogēnus no viena un tā paša materiāla. Šī pieeja ne tikai samazina atrisinājuma laiku pareiza diagnoze bet arī ietaupa pētniecības izmaksas.
6. PCR metode tiek uzskatīta par uzticamu, jo tika konstatēts tikai neliels skaits viltus negatīvu rezultātu. Līdz šim nav reģistrētas kļūdaini pozitīvas atbildes.

Kad tiek izmantota PCR diagnostika?

Lai kādas būtu infekciju PCR diagnostikas priekšrocības, šī metode ne vienmēr tiek izmantota. Piemēram, diagnosticējot toksoplazmozi, polimerāzes ķēdes reakciju veic tikai tad, ja ELISA analīze uzrādīja apšaubāmu vai pretrunīgu rezultātu. Izmantojot PCR metodi, nav iespējams izsekot slimības dinamikai. Piezīme sekojošos gadījumos kad šī pētījuma metode dos ticamus un efektīvus rezultātus:

• noteikt iepriekš minētajā panta attiecīgajā sadaļā minētās infekcijas slimības;
• plaši izplatīta uroģenitālo infekciju PCR diagnostika;
• noteikt STI grūtniecības laikā;
• HIV diagnosticēšanai;
• strīdīgās medicīniskās situācijās, lai apstiprinātu vai atspēkotu provizorisku diagnozi;
• noteikt paternitāti un ģimenes saites;
• izmanto genotipa noteikšanā, lai noteiktu iedzimtas noslieces;
• palīdz PCR metode medicīnas tiesu medicīnas nodaļas darbiniekiem ģenētiskā materiāla identificēšanai.

PCR grūtniecības laikā

Grūtniecei reģistrācijā obligāta pārbaude ar PCR metodi seksuāli transmisīvo infekciju agrīnai diagnostikai. Tā kā šādas slimības ir ārkārtīgi bīstamas normālai bērna piedzimšanas perioda gaitai. STI provocē augļa attīstības izbalēšanu, spontānos abortus, intrauterīnās deformācijas, nedzīvi dzimušus bērnus, iedzimtas patoloģijas. Savlaicīga infekcijas atklāšana un ārstēšana ievērojami palielina iespēju, ka grūtniecības iznākums būs labvēlīgs un veselīgs bērns piedzims.

Parasti topošā māmiņa iecelts visaptveroša pārbaude, kam ir nosaukums "PCR 6". Šāds pētījums ietver 6 dažādu infekciju analīzi. PCR diagnostika tiek veikta gan valsts, gan privātās iestādēs: Invitro, Happy Family, Uro-Pro un citas laboratorijas piedāvā šo pakalpojumu. Šī problēma ir sīkāk aprakstīta tālāk.

Tādējādi materiāls analīzei būs jāņem tikai vienu reizi. Veicot PCR diagnostiku grūtniecības laikā, ir nepieciešama uroģenitālā uztriepe, kas tiek ņemta no dzemdes kakla kanāla ar ginekoloģisko suku. Šī procedūra nav sāpes grūtniecei un nekādā veidā neietekmē augli.

PCR, lai noteiktu hepatītu

Lai noteiktu hepatīta izraisītāju, bieži tiek noteikta PCR diagnostika. Tas izskaidrojams ar to, ka šāda slimība bieži ir asimptomātiska un pāriet hroniskā smagā, neārstējamā stadijā. Ar PCR palīdzību hepatīts tiek atklāts agrīnā stadijā, kas veicina labvēlīgu izārstēšanu pēc iespējas īsākā laikā. Šāda infekciju PCR diagnostika tiek veikta lielākajā daļā privāto laboratoriju. Cena ir atkarīga no nosakāmā vīrusa veida un analīzes veida. Tātad vienkārša patogēna DNS klātbūtnes vai neesamības noteikšana asinīs maksā 400-600 rubļu. Kvantitatīvā metode maksās 1200-1500 rubļu.

Visaptverošs pētījums ar PCR

Vēl efektīvākai PCR metodes efektivitātei infekcijas slimību diagnostikā to plaši izmanto visaptverošs pētījums, kas palīdz samazināt diagnostikas un savlaicīgas ārstēšanas laiku. Tātad laboratorijas piedāvā "PCR-6" un "PCR-12" analīzi. Pirmajā kompleksā ietilpst dzimumorgānu infekciju PCR diagnostika, piemēram:

• ureplazmoze;
• hlamīdijas;
• mikoplazmoze;
• cilvēka papilomas vīruss;
• vienkāršs herpes;
• citomegalovīruss.

Šāds pētījums bieži tiek piešķirts sievietēm uz agri datumi grūtniecības laikā, kā arī grūtniecības plānošanas laikā.

"PCR-12" laikā papildus iepriekš minētajām slimībām tiek diagnosticētas:

• gonoreja;
• kandidoze;
• bakteriāla vaginoze;
• trichomoniāze;
• ureplazmoze;
• 1. un 2. tipa herpes.

Atkarībā no laboratorijas kompleksā iekļauto pētīto slimību saraksts var atšķirties. Ārsts izvēlēsies katrā konkrēts gadījums vispiemērotākā pārbaude. Jebkurā gadījumā visaptveroša analīze ar PCR prasīs daudz mazāk laika, pūļu un materiālu izmaksu.

Infekciju PCR diagnostika: kā pāriet?

Sagatavošanās PCR analīzei ietver ieteikumu ievērošanu noteikta veida materiāla savākšanai:

1. Noņemot uroģenitālo uztriepi, trīs dienas pirms ierosinātās analīzes jāatturas no seksuāla kontakta, pārtrauciet lietot antibakteriālas zāles un vietējās ziedes, krēmi, svecītes, nav iespējams veikt douching procedūru. Menstruālā plūsmas laikā materiāla paraugu ņemšana netiek veikta - analīze jāveic ne agrāk kā 3 dienas pēc menstruāciju beigām. Jums vajadzētu atturēties no urinēšanas 3 stundas pirms analīzes.
2. Vēnu asinis labāk ziedot no rīta, tukšā dūšā (lai gan tas nav likums). Iepriekšējā dienā jums jāierobežo alkohola un treknu produktu patēriņš.
3. Ziedojot spermu, trīs dienas jāatturas no seksuāla kontakta. Ieteicams ierobežot alkohola lietošanu, saunas apmeklēšanu, karstā vannā.
4. Urīns jāņem no rīta, pēc rūpīgas dzimumorgānu tualetes. Labāk ir savākt materiālu īpašā sterilā traukā. Materiāls jānogādā laboratorijā dažu stundu laikā.

Kā atšifrēt rezultātu?

Rezultātus nav grūti interpretēt pēc infekciju PCR diagnostikas. Kvalitatīvas metodes atšifrēšana sastāv no patogēna klātbūtnes vai neesamības novērtēšanas testa materiālā, kā arī patogēnā mikroorganisma veida noteikšanas. Ja testa materiālā tika atrasta mikroba DNS daļa, tad uz atbilstošās veidlapas tiek fiksēts pozitīvs rezultāts, kā arī norādīts, kāds mikroba veids ir noteikts. Ja materiālā nav patogēnu mikroorganismu, rezultāts būs negatīvs.

Kvantitatīvās analīzes rezultāti, piemēram, hepatīta diagnostikā, ir jāatšifrē, izmantojot laboratorijas noteiktos standartus. Tā kā mērvienības un kvantitatīvais faktors dažādās medicīnas diagnostikas iestādēs būtiski atšķiras. Uzticami, ņemot vērā visus pavadošos faktorus, tikai ārsts var atšifrēt šādu analīzi.

PCR metode (polimerāzes ķēdes reakcija) ir mūsdienu DNS diagnostikas "zelta standarts", ļoti jutīga molekulārās bioloģijas metode. izmanto medicīnā, ģenētikā, tiesu medicīnā un citās jomās. To bieži un veiksmīgi izmanto daudzu infekcijas slimību diagnostikā.

Infekcijas slimību diagnostika ar PCR

Pētījums ar PCR ļauj testa materiālā noteikt ne tikai pašu patogēnu, bet pat vienu svešas DNS fragmentu. Pētītais (bioloģiskais) materiāls ir: deoksigenētas asinis, epitēlija šūnas un dzimumorgānu izdalījumi, sēkla, siekalas, krēpas un citi bioloģiskie izdalījumi. Nepieciešamo bioloģisko materiālu nosaka aizdomīgā slimība.

PCR metode mūsu laikā, protams, ir spēcīgs diagnostikas instruments. Varbūt vienīgais pētījuma trūkums ir tā augstā cena.

Slimību sarakstā, kuru klātbūtni var noteikt ar PCR, ir:

• vīrusu un baktēriju pneimonija;
• tuberkuloze;
• masalas, masaliņas, cūciņas;
• visu veidu infekciozais hepatīts;
• salmoneloze, difterija;
• Helikobakterioze un slimības, ko izraisa zarnu infekcijas;
• STS (seksuāli transmisīvās slimības): gonoreja, hlamīdijas, ureaplazmoze, sifiliss, AIDS, dzimumorgānu herpes, gardnereloze un citi.

STI pārbaude ar PCR

Atšķirībā no tradicionālajiem testiem, PCR tehnika var noteikt seksuāli transmisīvās infekcijas (STI) pat tad, ja nav to pazīmju. Lai ņemtu bioloģisko materiālu, sievietes veic dzemdes kakla kanāla epitēlija šūnu nokasīšanu, vīriešiem - urīnizvadkanāla nokasīšanu. Ja nepieciešams, venozo asiņu pētīšanai izmanto PCR.

Tādējādi PCR tests STI ļauj identificēt:

• cilvēka imūndeficīta vīruss (HIV);
• bāla treponēma (sifilisa izraisītājs);
• herpes simplex vīruss un citomegalovīruss;
• cilvēka papilomas vīruss (HPV);
• hlamīdijas, toksoplazma, mikoplazma, ureaplazma un citas seksuālas infekcijas.

Ja PCR analīze tiek veikta pareizi, kļūdaini pozitīvu rezultātu iespējamība ir izslēgta. Atsevišķi ir jāpiemin cilvēka papilomas vīruss (HPV) un PCR metodes nozīme tā diagnostikā. Atšķirībā no onkocitoloģiskās uztriepes, PCR var noteikt konkrētu HPV veidu, jo īpaši tā onkogēnos 16. un 18. tipus, kuru klātbūtne sievietei draud ar tik nopietnu un bieži letālu slimību kā. Savlaicīga HPV onkogēno tipu noteikšana ar PCR palīdzību bieži vien ļauj novērst dzemdes kakla vēža attīstību.

Enzīmu imūntests (ELISA) un polimerāzes ķēdes reakcija (PCR): plusi un mīnusi

Kura diagnostikas metode ir labāka: PCR vai ELISA? Uz šo jautājumu nav pareizas atbildes, jo būtībā diagnozei, izmantojot šos divus pētījumus, ir atšķirīgi mērķi. Turklāt ELISA un PCR metodes biežāk tiek izmantotas kombinācijā.

PCR pētījums ir nepieciešams, lai noteiktu specifisko infekcijas izraisītāju, to var noteikt uzreiz pēc inficēšanās, neskatoties uz to, ka nav simptomātisku slimības izpausmju. Šī metode ir ideāli piemērota latentu un hronisku baktēriju un vīrusu infekcijas.Ar tās palīdzību vienlaikus var noteikt vairākus patogēnus, un terapijas laikā PCR metode ļauj novērtēt tās kvalitāti, nosakot svešās DNS kopiju skaitu.

Atšķirībā no PCR tehnikas, ELISA metode ir paredzēta, lai noteiktu nevis pašu infekcijas izraisītāju, bet gan organisma imūnreakciju pret to, tas ir, lai noteiktu antivielu klātbūtni un daudzumu pret konkrētu patogēnu. Atkarībā no konstatēto antivielu veida (IgM, IgA, IgG) ir iespējams noteikt infekcijas procesa attīstības stadiju.

Abas metodes, PCR un ELISA, ir ļoti uzticamas (attiecīgi 100 un 90%). Bet ir svarīgi atzīmēt faktu, ka ELISA analīze dažos gadījumos dod viltus pozitīvu (ja personai agrāk ir bijusi noteikta slimība) vai viltus negatīvu (ja infekcija ir pārgājusi salīdzinoši nesen) rezultātu.

Mūsdienās PCR analīze tiek uzskatīta par vienu no uzticamākajām metodēm dažādu infekcijas slimību diagnosticēšanai. Turklāt metode kļūst pieejamāka. Tā kā ir augsts specifikas līmenis, iespēja iegūt nepatiesus rezultātus ir izslēgta.

Analīzes metodoloģija

Analīzes laikā testa materiāls tiek ievietots īpašā ierīcē. Pievienojiet fermentus, kas ir iesaistīti ģenētiskā materiāla veidošanā. Turklāt notiek atkārtota patogēna DNS vai RNS kopēšana. No cikla uz ciklu DNS kopiju skaits palielinās līdz tādam daudzumam, kurā ir viegli identificēt patogēnu.

PCR asins analīzi visbiežāk izmanto klīniskā prakse lai noteiktu slimības infekciozo cēloni. Ir iespējams pētīt arī urīnu, uztriepi no rīkles un citus bioloģiskie materiāli. Sievietēm PCR analīzei izmanto dzimumorgānu sekrēcijas, dzemdes kakla kanāls. Tajā pašā laikā ir svarīgi zināt, kā sagatavoties PCR analīzei sievietēm, lai rezultāts būtu pēc iespējas ticamāks. Galvenais ir ievērot šādus noteikumus:

• atturēšanās no dzimumakta trīs dienas pirms pārbaudes;
• Lielākā daļa baktērijas var "izskalot" ar urīnu, tāpēc pirms pētījuma nevajadzētu urinēt;
• neveiciet pētījumu tūlīt pēc menstruācijas, jums jāgaida 3-5 dienas pēc menstruāciju beigām.

Pirms asins analīzes nav īpašas sagatavošanas.

PCR - ko parāda analīze?

Ir zināms, ka PCR analīze parāda dažādu vīrusu un bakteriālas infekcijas. Šī metode ir efektīva arī latentu, hronisku infekciju noteikšanai. STI PCR analīze ļauj izolēt patogēnu aģentu pat atsevišķu vīrusu un baktēriju šūnu klātbūtnē. Ir vērts atzīmēt, kuri PCR testi ir iekļauti dzimumorgānu infekciju blokā, tie ir:

• hlamīdijas;
• ureaplazmas (parvum un urealiticum);
• gonorejas izraisītājs;
• Dažādi veidi cilvēka papilomas vīruss;
• trichomonas;
• gardnerella;
• Candida.

Dzimumorgānu infekcijas slimību gadījumā PCR materiāls ir uztriepe no dzemdes kakla kanāla, urīnizvadkanāla un maksts. Sagatavošanās ieņemšanai jāuztver ar lielu atbildību. Plānojot grūtniecību, PCR testi ir nepieciešami gadījumā, ja ir aizdomas par biežāko infekcijas slimības. Un infekcijas klātbūtnē labāk ir atlikt grūtniecību. Ir vērts atzīmēt, ka testi, lai identificētu iepriekš minētos patogēnus, ir jānodod ne tikai sievietei, bet arī vīrietim.

Turklāt PCR metode ļauj identificēt šādus patogēnus:

• B un C hepatīta vīrusi;
• mikobaktērijas tuberkuloze;
• herpes ģimenes vīrusi, tostarp Epšteina-Barra vīruss un citomegalovīruss;
• helikobaktēriju infekcija.

Rezultātu interpretācija

PCR analīzes atšifrēšana nav grūta. Parasti PCR analīžu rezultātus var iegūt šādi:

Dažos gadījumos tiek veikta mikroorganismu kvantitatīvā noteikšana. Tas jo īpaši attiecas uz slimībām, ko izraisa oportūnistiski patogēni. Tā kā šīs baktērijas parāda savu negatīvo ietekmi tikai tad, ja to daudzums ir pārmērīgs. Arī kvantitatīvā PCR analīze ir svarīga terapeitiskās taktikas izvēlei un vīrusu infekciju, piemēram, HIV un hepatīta vīrusu, ārstēšanas uzraudzībai.