pcr çalışması nedir Teşhis için biyomateryal nasıl toplanır

Doktora Pokrovskaya MS,
karşılık gelen üye RAMN, Prof. Smirnov G.B.
(NIIEM, Rusya Tıp Bilimleri Akademisi'nden N.F. Gamaleya'nın adını almıştır ve JSC "LAGIS")

giriiş

Bir hastayı iyileştirmek için tam olarak neyle hasta olduğunu bilmeniz gerektiği uzun zamandır iyi bilinmektedir. Hastalığın türünü belirleme sürecine tanı denir. Herhangi bir hastalığın teşhisi bir doktor tarafından yapılır (anamnez çalışmasına, gözlemlere dayanarak) klinik bulgular ve veri analizi laboratuvar araştırması), bundan sonra tedaviyi reçete eder. Günümüzde doktor teşhis koyarken laboratuvar verilerini kullanır ve bunlar olmadan doğru teşhis koymak ya zor ya da bazı durumlarda imkansızdır.

Teşhisin bir hastalık tanıma süreci olarak önemi, erken ve doğru bir teşhisin rasyonel ve etkili terapi, çoğu durumda tahmin etmeye izin verir olası seçenekler hastalığın seyri ve sonucu.

Bulaşıcı hastalıkların tanısında, dahil. STD'leri tanımlamak önemlidir etiyolojik faktör(etken madde) ve hastalığın evresini belirlemek, yani etiyotropik ve yeterli tedavi seçimi için gerekli bilgileri elde etmek, hastalığın seyrini ve tamamlanma zamanlamasını tahmin etmek.

Modern laboratuvar teşhisinin karakteristik özellikleri, bilinen yöntem ve tekniklerin sürekli yenilenmesi ve iyileştirilmesidir. Bunun nedeni, son yıllarda nasıl sürekli bir değişiklik olduğu gerçeğidir. klinik tablo bulaşıcı hastalıklar ve patogenezlerinin özellikleri. Örneğin, iyi bilinen oldukça tehlikeli patojenler, silinmiş hastalık formlarına neden olabilir veya tam tersi: fırsatçı veya patojenik olmayan mikroorganizmalar, ciddi formlara neden olur. Patojenik mikroorganizmaların tropizmi değişiyor (diğer organları ve dokuları etkiliyorlar) ve sonuç olarak yeni bulaşıcı süreç biçimleri ortaya çıkıyor. Kronik, kalıcı enfeksiyon biçimleri ortaya çıkar ve patojenlerin antijenik yapısı değişir, mikroorganizmalar ekilmemiş bir duruma geçer. Bulaşıcı hastalıkların seyrinde klasik formlardan sapmalar ve atipik formların ortaya çıkışı iki durumla ilişkilidir. İlk olarak, popülasyonun bir bölümünde bağışıklık sisteminin durumu değişti, çeşitli doğadaki bağışıklık yetersizliği durumları yaygın hale geldi. İkincisi, patojenlerin kendileri değişiyor. Yani mikroorganizmalarda evrim sürecine tanık oluyoruz.

Bütün bunlar tanıyı zorlaştırır ve tedavinin etkinliğini olumsuz etkiler. Kullanım rolü modern yöntemler tanı için laboratuvar araştırmaları artık çok önemli hale geliyor.

Bulaşıcı hastalıkların teşhisi için, aralarında en önemli yeri hastalığa neden olan ajanı tanımlamayı ve böylece etiyolojik tanıyı koymayı amaçlayan spesifik yöntemlerle işgal edilen çeşitli laboratuvar ve enstrümantal yöntemler kullanılmaktadır.

Bu tebliğin konusu, bulaşıcı hastalıkların laboratuvar teşhisinin seçilmiş bölümleridir.

Enfeksiyonların laboratuvar tanısında temel kavramlar ve yöntemler

Laboratuvar teşhisinin temel göstergeleri, enfeksiyöz ajanları (mantarlar, protozoalar, bakteriler ve virüsler) tespit etme yöntemlerinin duyarlılığı ve özgüllüğüdür.

Duyarlılık- Bu minimum miktar Bu yöntemle tespit edilebilen malzeme. Materyal, tüm mikroorganizmalar ve patojen moleküllerinin fragmanları olabileceği gibi, bir enfeksiyona yanıt olarak insan vücudu tarafından üretilen spesifik antikorlar da olabilir. Yöntem ne kadar az malzeme ortaya çıkarabilirse hassasiyeti o kadar yüksek olur. Bir laboratuvar çalışması, numunede bulunan ve tespiti için test sisteminin geliştirildiği mikroorganizmaları tespit etmezse, sonuca yanlış negatif denir. Yöntemin duyarlılığı ne kadar yüksek olursa, yanlış negatif [yanlış (-)] sonuçlar o kadar az olur.
özgüllük- bu, yöntemin, test sisteminin geliştirildiği tespiti için yalnızca nesnenin numunesindeki varlığını gösterme yeteneğidir. Yöntem, numunede orada bulunmayan mikroorganizmaların varlığını gösteriyorsa, sonuca yanlış pozitif denir. Yöntemin özgüllüğü ne kadar yüksek olursa, o kadar az yanlış pozitif [yanlış (+)] sonuç elde edilir.
Tüm laboratuvar teşhis yöntemleri iki gruba ayrılabilir: mikroorganizmaların doğrudan ve dolaylı tespit yöntemleri.

Doğrudan Yöntemler Enfeksiyöz ajanları veya patojenin bir parçası olan veya onun tarafından üretilen materyali doğrudan tespit ettikleri için bu şekilde adlandırılmıştır. Genellikle bunlar antijenler veya genetik materyaldir. Doğrudan yöntemler aşağıdakileri içerir (Tablo 1):

Tablo 1. Doğrudan laboratuvar teşhisi yöntemleri
Yöntemler	Yöntem ilkesi	özgüllük	Duyarlılık
mikrobiyolojik	Saf patojen kültürünün izolasyonu	Laboratuar teşhisinin %100 "altın standardı"	1000-10000 hücre/ml
Sitolojik (mikroskopi)	Boyalı smearların incelenmesi	20-80%	1.000-100.000 hücre/ml
İmmunositolojik ve serolojik	RIF, ELISA antikorlarına bağlandıktan sonra antijenlerin saptanması	70-90%	1.000-100.000 hücre/ml
moleküler biyolojik	Patojen genomunda belirli bir DNA/RNA bölgesinin belirlenmesi	%99-100 "altın standart"a eşittir	200 hücre/ml (reaksiyon başına 1 hücre)

Yanlış (+) sonuçlar, sitolojik yöntem söz konusu olduğunda, sonuçların değerlendirilmesinin öznelliği ile, immünolojik yöntemler söz konusu olduğunda - antijenlerin antikorlarla çapraz reaksiyonu ile ilişkilidir.

Doğrudan yöntemlerde yanlış (-) sonuçlar, klinik materyalin örneklenmesi sırasında patojenin erişilememesinden, mikrobiyolojik yöntem için - örneğin taşınması sırasında ve kültürlenemeyen bir form durumunda mikroorganizmanın ölümü nedeniyle olabilir. .

Dolaylı Yöntemler Bu şekilde adlandırılmış olmaları, çünkü patojenin kendisinin materyalini değil, bir kişinin bu tür bir enfeksiyona yanıt olarak ürettiği spesifik antikorları, yani immünolojiktir. Bu yöntemler şunları içerir: komplement bağlanma reaksiyonu (RCC), indirekt immünofloresan reaksiyonu (RNIF), mikroimmünofloresan reaksiyonu (MIF), rekombinant lipopolisakarit ELISA (r - ELISA), enzim immün testi (ELISA). Bu yöntemlerin duyarlılığı 1000-100000 hücre/ml'dir.
İmmünolojik yöntemler kullanıldığında, hemen hemen tüm durumlarda, yanlış (+) sonuçlar, antikorların antijenlere spesifik olmayan bağlanması veya antijenlerin antikorlarla çapraz reaksiyonu ile ilişkilidir. Yanlış (-) sonuçlar, numunede yetersiz miktarda spesifik antikor veya antijen bulunması ve tespit yöntemlerinin hassasiyetinin yetersiz olması nedeniyle ortaya çıkar.

Modern teknolojideki önemli ilerlemelere rağmen laboratuvar teşhisi pratikte hiçbir yöntem %100 duyarlılık ve özgüllük kombinasyonunu garanti etmez. Yani %100 doğru cevap vermiyor. Bu nedenle, bir teşhis koymak için, bir doktorun genellikle en az iki tane kullanması gerekir. farklı yöntem ve her çalışma en iyi şekilde iki veya üç tekrarla yapılır. Bu, tüberküloz, klamidya ve diğer bazı hastalıkların tanısında bir gerekliliktir (1).

A, M, G sınıflarının immünoglobulinlerinin saptanmasının tanısal değeri

Serolojik teşhisler üzerinde daha ayrıntılı olarak duralım (kan serumundaki antikorların ELISA ile belirlenmesi). Enfeksiyöz mikroorganizmaların varlığına yanıt olarak insan vücudunda oluşan çok spesifik antikorların (AT) belirlenmesine dayanır. Bu antikorlar, M, A, G sınıflarının immünoglobulinleridir (Ig). Antikorlar, antijenlerle etkileşime girerek enfeksiyöz ajanları nötralize eder. Bir antijen, insan vücudunda spesifik antikorların oluşumuna (bağışıklık tepkisi) neden olan enfeksiyöz bir ajanın (mikroorganizma) spesifik bir parçasıdır. Serolojik reaksiyonların temeli spesifik antijen-antikor etkileşimidir. IgM, IgA, IgG sınıflarındaki antikorların saptanmasının tanı koymak için ne verdiğini düşünelim (Tablo 2).

Tablo 2. ELISA ile kan serumundaki antikor çalışmasının sonuçlarına göre bulaşıcı bir hastalığın evresinin belirlenmesi
Hastalığın evresi (formu)	Antikorların serumda görünme sırasına göre	Titre dinamikleri (2-3 hafta aralığında)
Birincil enfeksiyonlu akut	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA veya - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ erken veya erken erken erken IgG	Enfeksiyon başlangıcından itibaren geçen süreye bağlı olarak titrelerde (7. günden sonra IgM) artış veya azalma
İkincil enfeksiyon ve reaktivasyon (nüks)	IgG ⇒ IgA, neredeyse hiç IgM yok ⇒ erken veya erken erken IgG	Titrelerde hızlı artış veya düşüş
Kronik	IgG ⇒ IgA, bazen sadece IgA veya sadece IgG	Sürekli düşük titreler, sürekli olarak yüksek olabilir - şiddetli artan enfeksiyon veya sistemik lezyonlar durumunda.
sebat, taşıma	IgA veya IgG	Sabit (birkaç hafta) düşük titreler (mikroorganizmaların değişen antijenik yapısından dolayı antikorlar her zaman saptanmaz)
uzun süreli hastalık	IgG	Sürekli olarak düşük titreler

Çeşitli sınıflardaki antikorların kantitatif tespiti, hastalığın seyrinin evresini ve doğasını belirlemeye yardımcı olur. Kantitatif sonuçlar yorumlanırken, bağışıklık yanıtının insan vücudu enfeksiyon gelişimine ve ürettiği antikorların seviyesine, patojenlerin özelliklerine, aşamaya bağlıdır. bulaşıcı süreç ve bağışıklık sisteminin bireysel özellikleri. Şiddetli immünsüpresyon durumunda, AT sentezi tamamen baskılanabilir. Bu nedenle, özellikle atipik enfeksiyon formlarında teşhis koymak için, doktor bir çalışmanın kantitatif sonucunu açık bir şekilde yorumlayamaz.

Çeşitli enfeksiyöz ajanlara karşı kantitatif antikor tespiti sonuçlarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için, eşleştirilmiş serum prensibinin kullanılması gerekir (2-3 hafta sonra çalışmayı tekrarlayın ve sonuçları karşılaştırın). Bu tür çalışmalar, antikorların saptanma dinamiklerini analiz etmeyi ve böylece bulaşıcı sürecin gelişimi hakkında gerekli bilgileri elde etmeyi mümkün kılar. 2-3 hafta içinde antikorlarda dört kat artış, bir enfeksiyon gelişimini gösterir.

Tam da bu tür ikili çalışmaları yürütebilmek için kantitatif ELISA sonuçlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

Tanımlamanın geleneksel yolu Akut enfeksiyon- Kan serumunda IgM tespiti. Modern diyagnostik test sistemleri, IgM'ye ek olarak, aşağıdakiler gibi diğer erken antikorların saptanmasını mümkün kılar: 1) Virüslerin erken erken proteinlerine yönelik IgG ve 2) düşük avidli IgG. Ayrıca, virüslerin erken erken proteinlerine yönelik IgG, hem birincil akut enfeksiyonun hem de nüksetmenin (kronik enfeksiyonun alevlenmesi) ve yeniden enfeksiyonun, örn. kural olarak yalnızca birincil enfeksiyon sırasında üretilen IgM'nin aksine akut enfeksiyonun tüm varyantları.

polimeraz zincirleme reaksiyonu

Moleküler teşhis yöntemlerinin tıbbi mikrobiyoloji pratiğine girmesi, elbette, hastalıkların patogenezini inceleme olanaklarını kökten genişlettiği, teşhisleri temelden iyileştirdiği ve hatta tedaviye yönelik yeni yaklaşımları özetlediği için önemli bir olaydı. Yüksek duyarlılık ve özgüllüğün optimal kombinasyonunu veren PCR'ye dayalı moleküler teşhis yöntemi giderek daha yaygın hale geliyor.

Genel olarak moleküler teşhis ve özel olarak PCR, test numunesinde, çoğunlukla DNA olmak üzere spesifik nükleik asitlerin varlığının belirlenmesine dayanır.

DNA, bir organizmanın tüm özelliklerini belirleyen nükleotit dizisi olan çift sarmallı (çift sarmallı) bir polimer molekülüdür. Hücreler bölündüğünde, DNA ikiye katlanır ve iki yavru hücrenin her biri, ana hücrenin genetik materyalinin tam bir kopyasını alır. Bir DNA molekülünün duplikasyonuna replikasyon denir. İki ilk (matris) DNA zincirinde, yeni kardeş zincirler (matrise tamamlayıcı) inşa edilir. Replikasyon, anahtar elemanı DNA polimeraz olan enzimatik bir kompleks tarafından sağlanır. DNA polimerazın replikasyonu başlatabilmesi için, kalıba ek olarak, bir primere (primer) - şablonla tamamlayıcı olarak ilişkili küçük bir DNA fragmanına ihtiyacı vardır. DNA polimeraz, olduğu gibi, mevcut şablon üzerinde yeni bir DNA zinciri oluşturarak bu tohumu uzatır. Normal olarak, bir hücre veya virüsteki tüm DNA, doğada çoğalır ve bu işlemin ürünü, orijinal DNA'nın iki özdeş kopyasıdır.

Artık replikasyonla ilgili en önemli şeyi kısaca hatırladığımıza göre, polimeraz zincir reaksiyonunu açıklamaya geçebiliriz. PCR 1983 yılında keşfedildi ve şu anda bulaşıcı ve genetik hastalıkların teşhisi alanında bilimsel ve pratik araştırmalar için yaygın olarak kullanılıyor. erken tanı bazı onkolojik patolojiler. Bu yöntemin keşfi için, 1995 yılında Cary Mullis en prestijli bilimsel ödül olan Nobel Ödülü'ne layık görüldü.

Bu reaksiyon sırasında, DNA da kopyalanır, ancak doğadaki olağan şekilde değil. Birincisi, mikroorganizmanın DNA'sının tamamı değil, sadece küçük bir parçası (hedefi) kopyalanır.

İkincisi, PCR ürünü iki değil, orijinal hedefin milyonlarca kopyasıdır. Bu tekrarlanan replikasyona amplifikasyon denir.

Farklı cins ve bakteri türlerinin yanı sıra virüsler de farklı genetik metinlere (DNA'nın nükleotid dizileri) sahiptir. Modern bilgisayar programları, çeşitli organizmaların deşifre edilmiş DNA dizilerinin bir veritabanını içerir. Tanısal bir PCR test sistemi geliştirirken, belirli bir patojen için kesinlikle spesifik olan küçük bir DNA parçası (hedef) bulunur. PCR ile amplifiye edilen bu bölgedir ve ardından amplifikasyon ürünü (amplikon) agaroz jel elektroforezi ile tanımlanır.

Belirli bir mikroorganizmaya özgü bir DNA fragmanını tanımlayarak, mikroorganizma böylece belirlenir.

Enfeksiyonların her tanı döngüsü üç aşamada gerçekleşir (Şek.):

Denatürasyon - çift sarmallı DNA zincirlerinin çözülmesi - 95 0 C sıcaklıkta gerçekleşen enzimatik bir işlem değildir.
Astarların eklenmesi (tavlama). PCR'de replikasyon sürecini başlatmak için, reaksiyon karışımına fazla eklenen kısa tek sarmallı DNA (15-30 baz uzunluğunda) primerler kullanılır. Özellikle (tamamlayıcı eşleştirme ilkesine göre) seçilen hedefi sınırlayan kısa bölümlere bağlanırlar. Bu aşama enzimatik değildir ve reaksiyon karışımının 55-65 0 C'de inkübasyonu sırasında gerçekleşir. Primerler sadece bu patojene özgü seçilmiş DNA fragmanlarına bağlanır ve diğer DNA sekansları ve çeşitli mikroorganizmalar ile etkileşime girmez). Tanısal PCR test sisteminin mutlak özgüllüğünü sağlayan şey budur. Şablon DNA'ya göre fazla miktarda DNA primeri, yöntemin yüksek hassasiyetini sağlar. Yani ilk PCR solüsyonundaki primerler %100 olasılıkla bağlanmak için bir hedef bulacaktır.
Primerlerin eklenmesi sonucunda "tohum" kompleksleri olan yapılar [DNA şablonu + primer] oluşur. Primerlerin tamamlanması, 3'-uçlardan başlayarak, tek sarmallı DNA fragmanlarının şablonları üzerinde tamamlayıcı sentez ile başlar. Bu işlem, özel bir enzim - Taq polimeraz (termostabil DNA polimeraz) ve nükleotidler (bir yapı malzemesi olarak) yardımıyla gerçekleştirilir.
Denatürasyon adımından sonra yeni sentezlenen çift sarmallı DNA, karışımda fazla olan primerleri tekrar bağlar. Tamamlandıktan sonra ortaya çıkan yapılar, primer dizileri ile sınırlı spesifik DNA fragmanları oluşturur. Bu nedenle, PCR için yalnızca bir DNA molekülü başlangıç olsa bile, amplifikasyon 25-40 döngü içinde gerçekleşir, yani; sentezlenmiş çok sayıda(108-109 kopya), agaroz jelde elektroforezden sonra reaksiyonun sonucunu görsel olarak kaydetmek için yeterli spesifik DNA fragmanlarının (amplikonlar).

PCR bir siklatörde gerçekleştirilir veya bisikletçi- belirtilen sıcaklık değişim modunun otomatik olarak döngüsel olarak gerçekleştirildiği ve sırayla 1, 2, 3 aşamayı tekrar tekrar geçmenize izin veren bir cihaz.

Reaksiyonun muhasebeleştirilmesi, agaroz jel elektroforezi kullanılarak gerçekleştirilir. Negatif yüklü DNA molekülleri, bir elektrik alanının etkisi altında katottan anoda jel içinde hareket ederken, DNA fragmanlarının belirli bir süre boyunca ilerlemesinin uzunluğu, boyutlarına bağlıdır. Jeldeki DNA, etidyum bromür ile boyanır ve ultraviyole ışık altında görünür hale gelir. PCR sonucunda test numunesinde amplikonlar (aynı boyuttaki DNA fragmanları) birikmişse, başlangıçtan aynı uzaklıkta olacaklar ve jel izi üzerinde bir bant olarak görüneceklerdir. Bandın jel izi üzerindeki konumu, kullanılan primer çifti için hesaplanana karşılık geliyorsa, örn. pozitif kontrol bandı ile başlangıca aynı uzaklıkta, bu da çalışmanın sonucunun pozitif olduğu anlamına geliyor.

Her deneyde olduğu gibi, PCR sonuçları dikkate alındığında, pozitif ve negatif kontroller sağlanır. Herhangi bir teşhis test sistemi, belirtilen kontrollerin varlığını içeren onaylanmış bir yönetmeliğe sahip olmalıdır.

Pozitif kontrol, belirlenmekte olan mikroorganizmaya karşılık gelen spesifik bir amplikonun birikmesi için bir DNA şablonuna sahip bir numunedir.

Negatif kontrol - su, insan DNA'sı veya bu test sistemi tarafından belirlenenle yakından ilişkili mikroorganizmaların DNA'sı.

PCR yönteminin avantajları

PCR teşhisi, bir numunede bulaşıcı hastalıkların patojenlerinin tek hücrelerinin DNA'sının spesifik olarak tespit edilmesini sağlayan en modern ve gelişmiş laboratuvar teşhis yöntemlerinden biridir.

PCR dahil olmak üzere moleküler tanı yöntemleri ile diğer geleneksel yöntemler arasında temel bir fark vardır. Bu fark şu ki geleneksel yöntemler mikroorganizmaların genlerinin aktivite ürünlerini (proteinler, antijenler ve daha karmaşık organize özellikler) ortaya çıkarırken, PCR doğrudan genetik materyali ortaya çıkarır. Böylece, mikroorganizma, genomun işleyişinin özelliklerinden bağımsız olarak, herhangi bir atipik tezahürden bağımsız olarak PCR ile tespit edilir.

PCR'nin mümkün olan maksimum hassasiyete ulaştığını söyleyebiliriz. PCR test sistemlerinin hassasiyeti numune başına 10-1000 hücre iken, immünolojik ve mikroskobik yöntemlerin hassasiyeti numune başına 1000-100000 hücredir. PCR tabanlı test sistemleri, yüksek hassasiyetleri nedeniyle, çalışılan materyalin (etken madde) çok küçük olduğu durumlarda vazgeçilmezdir.

PCR testi, hassasiyetinin yüksek olması nedeniyle hastalıkların erken teşhisine (örneğin, önleyici muayeneler popülasyon), antibiyotik tedavisinin arka planına karşı tanıyı netleştirin, tedaviyi kontrol edin (tedavinin etkinliği) ve ayrıca kalıcı mikroorganizmaları tespit edin. Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum gibi bazı patojenler için, Gardnerella vajinalis, Candida albicans, teşhis amaçlı PCR test sistemlerinin hassasiyeti yüksek olmamalıdır. Hassasiyet göstergeleri, ml başına 105-6 hücreden başlayarak özel olarak geliştirilmiş ve onaylanmıştır. Bu tür test sistemleri, bu mikroorganizmaların teşhis açısından önemli bir kısmını saptar (2,3).

Yetiştirilmesi zor, ekilmemiş ve kalıcı patojenik mikroorganizma formlarının tespitinde, yalnızca patojenin DNA'sını tespit eden doğrudan bir yöntem gerekli teşhis cevabını sağlar. Diğer tanı yöntemleri (immünolojik, bakteriyolojik, mikroskobik) zor, hatta imkansızdır. Kalıcı mikroorganizmalar söz konusu olduğunda, bu, patojenlerin antijenik yapısındaki değişikliklerden veya bu tür mikroorganizmaların ekilmemiş bir forma geçişinden kaynaklanabilir. Gizli ve kronik enfeksiyonları teşhis ederken bu hatırlanmalıdır.

PCR yönteminin yüksek özgüllüğü, primerlerin nükleotit dizisi ve bunların kesinlikle bu patojen için belirli bir DNA fragmanına (hedef) bağlanma koşulları ile belirlenir. Seçilen primerlere bağlı olarak, PCR test sistemi aynı türe ait mikroorganizmaların cinslerini, türlerini, serotiplerini ve hatta patojenik ve patojenik olmayan suşlarını ayırt edebilir.

Enfeksiyonları teşhis etmek için PCR kullanarak, patojenlerin kullanılan birçok antibiyotiğe duyarlılığını (veya direncini) belirlemek mümkündür. Bu, özellikle mikrobiyolojik araştırma yönteminin uygulanamadığı durumlarda geçerlidir.

Potansiyel olarak enfeksiyöz ajanlar içeren herhangi bir klinik materyal - kan, serum, lavaj sıvısı, balgam, tükürük, mide suyu, biyopsi materyali, yaymalar, yıkama sıvıları - PCR analizi için uygundur. İncelenen malzeme, çevresel nesnelerden (yıkanmalar, baskılar, lekeler, su, toprak vb.) Örnekler olabilir.

PCR, bu PCR test sisteminin kullanımı için izinlerde onaylanan düzenlemelere standart uyumu sağlayan ve sonuçların yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirliğini sağlayan birleşik ve otomatik bir yöntemdir.

PCR ile laboratuvar teşhisi - hızlı ve güvenilir yol bulaşıcı hastalıkların patojenlerinin tespiti. PCR laboratuvarı, materyalin çalışmaya teslim edildiği andan itibaren 48 saat içinde cevap verir. (Her numune için net inceleme süresi sadece birkaç saattir.)

Bir klinik numunede aynı anda 20'den fazla patojen belirlenebilir.

Klinik bir numune üzerinde bir çalışma yürütürken önemli bir husus, aşağıdakilere uygunluktur: klinik materyalin toplanması ve saklanması için kurallar. İşte sadece bazı genel öneriler:

Klinik materyalin örneklenmesi, mikroorganizmaların beklenen yaşam alanlarından ve enfeksiyon gelişiminden gerçekleştirilir (bunun için giriş kapısı, dağıtım yolları, üreme alanları ve istenen mikroorganizmaları izole etme yolları dikkate alınmalıdır).
Alınan malzemedeki deşarj miktarı küçük olmalıdır (“bir kibrit başı büyüklüğünden” fazla olmamalıdır). Fazla akıntı, mukus ve irin, DNA ekstraksiyon kalitesini olumsuz etkiler ve depolama ve taşıma sırasında DNA bozulmasına katkıda bulunur.
Klinik materyalden numune almak için sadece tek kullanımlık fırçalar veya sürüntüler kullanmak gereklidir. Klinik materyali solüsyonlu bir laboratuvar tüpüne yerleştirirken, steriliteye dikkat edin.

Moleküler teşhisin önemi

Moleküler teşhisin önemini gösteren en çarpıcı örneklerden biri, yüksek onkojenik riskli papillomavirüs enfeksiyonunun tespitidir. Tüm papillomavirüsler malign büyümeye neden olmaz. Kansere neden olma olasılığı yüksek virüs genotipleri ve iyi huylu denilen genotipler vardır. Birincisi genotip 16, 18 (bölgemizde yaygın), 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 ( P291) ve MM9 (P238A). Genotip 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66 ve MM8 (P155) iyi huylu kabul edilir. Papillomavirüs genotipinin tanımlanması mümkündür ve PCR kullanılarak gerçekleştirilir (4,5).

Papillomavirüs tipleri 16,18, yıllarca (5 yıla kadar) klinik belirtilere neden olmadan serviksin skuamöz epitel hücrelerinde kalır. kuluçka süresi), göze çarpan neoplazi oluşumuna kadar. Bu tür vakalarda erken teşhis, ancak popülasyonun PCR kullanılarak önleyici muayeneleri ile mümkündür. Kansere neden olma olasılığı yüksek olan papilloma virüs türlerinin DNA'sının tespiti durumunda, hasta bir onkoloğa başvurmalı, ayda bir ziyaret etmeli, klinik belirtileri izlemelidir. Böylece, bu durumda PCR, rahim ağzı kanserinin önlenmesini veya başlamamasını mümkün kılan erken teşhis yapılmasını mümkün kılar.

Bazı durumlarda, hastalığın belirli evrelerinde, patojenler klasik mikrobiyolojik yöntemlerle izole edilememektedir. Bunun nedeni, mikroorganizmaların içeride olabilmesidir. epitel hücreleri, dokularda veya mukusta (örneğin, klamidya, mikoplazmalar, ürelazmalar için, tüm virüsler hücre içi lokalizasyon ile karakterize edilir ve Trichomonas ve gonokok hem hücre içi hem de hücre dışı olabilir). Ek olarak, bazı bakteriler, belirli faktörlerin etkisi altında, kültüre alınamayan formlara veya ekilmemiş bir duruma geçebilir. Bir örnek, klamidyanın bilimsel ve tıbbi çalışmasıdır. Chlamydia trachomatis'in enfeksiyon odağında saptanma süresi, doku kültürü yöntemleri, direkt floresans, PCR (DNA tespiti) ve Western blot (RNA tespiti) kullanılarak karşılaştırıldı. Nükleik asitlerin belirlenmesine yönelik yöntemlerin, odaktaki patojeni geleneksel yöntemlere göre 4 hafta daha uzun süre (primer enfeksiyondan 16 haftaya karşı 12 hafta sonra) saptadığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada, bulaşıcı süreç sırasında klamidyanın ekilmemiş bir duruma geçme olasılığı hakkında bir sonuca varıldı. Bu durumda klamidya epitel hücrelerinde inflamasyona neden olmaya devam eder veya varlığını sürdürür, ancak mikrobiyoloji tarafından saptanmaz (6).

Şu anda, moleküler teşhisin önemini gösteren çok büyük miktarda materyal birikmiştir, ancak bu yayının sınırlı hacmi nedeniyle diğer örnekleri dikkate alamıyoruz.

Laboratuvar teşhis yöntemlerinin kullanımı için strateji

Bulaşıcı hastalıkların laboratuvar teşhisinin gelişiminin mevcut aşamasında, bulaşıcı bir hastalığın etiyolojik teşhisini oluşturmak için çeşitli laboratuvar yöntemlerinin kullanılmasını içeren entegre bir yaklaşıma ihtiyaç duyulduğu açıktır. Doktor, anamnez ve klinik belirtileri inceledikten sonra bir veya daha fazla laboratuvar araştırma yönteminin kullanılmasına karar verir. Patojenlerin biyolojilerinin özelliklerine ve bunlarla etkileşimlerine bağlı olarak farklı yöntem kombinasyonları kullanılır. bağışıklık sistemi kişi, hem de hastalığın şekli.

Örneğin klamidya, herpes grubu virüsler, toksoplazma gibi hastalıkların laboratuvar tanısı için PCR ve ELISA çalışmalarının sonuçları analiz edilir. Ve mikoplazmoz ve ureaplasmosis'in laboratuvar teşhisinde, antibiyotiklere duyarlılığın belirlenmesi ile kültürlerin izolasyonu ile bir PCR kombinasyonu kullanılır. Spesifik olmayan fırsatçı mikroflorayı tanımlamak için smear mikroskopisi ve mikrobiyolojik kültür izolasyon yöntemi kullanılır.

Klinisyen, hastanın öyküsünün, klinik belirtilerinin ve laboratuvar tanısal verilerinin incelenmesine dayalı olarak bir tanı koyar.

Edebiyat:

Cinsel Yolla Bulaşan Enfeksiyonlar, No. 2, s. 21-24, 2002. Ürogenital klamidyal enfeksiyon. Teşhis ve tedavi yaklaşımları. G.A. Dmitriev, TsNIKVI Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı, Moskova.
Öğretici. Sürekli Tıp ve Eczacılık Eğitimi için Tüm Rusya Eğitim, Bilim ve Metodoloji Merkezi. Moskova, 1999. Vajinanın mikroekolojisi. Vajinal disbakteriyozda mikrofloranın düzeltilmesi. VM Korshunov, ... L.I. Kafarskaya, ... V.V. Smeyanov. Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı, Rusya Devlet Tıp Üniversitesi, MIMSR, RMAPO, Moskova.
Cinsel Yolla Bulaşan Enfeksiyonlar, No. 1, s. 8-15, 2002. Ürogenital hastalıkların oluşumunda Ureaplasma urealiticum'un önemi konusunun mevcut durumu. İÇİNDE VE. Kisina, O.S. Zagrebina, K.I. Zabirov, V.V. Meshkov. Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı'ndan TsNIKVI, Moskova Sağlık Bakanlığı'na bağlı 47 No'lu Şehir Klinik Hastanesi.
Karsinojenez. D.G. tarafından düzenlenen bir yazar ekibi. Zaridze. Bilimsel dünya, 2000, Moskova. Papillomavirüsler ve servikal karsinogenezdeki rolleri. F.L. Kiselev. Rusya Tıp Bilimleri Akademisi Kanser Araştırma Merkezi.
Tıbbi laboratuvar teşhisi(programlar ve algoritmalar). El kitabı, prof. A.I. Karpishchenko, 2001, Intermedica, St. Petersburg.
bulaştırmak. Immun., Mayıs 1992, 2040-2047, Cilt 60, No. 5. Kültür negatif bir durumda klamidyal RNA ve DNA'nın gösterilmesi. SM Hollanda, …İK Taylor. Bulaşıcı Hastalıklar Bölümü, Johns Hopkins Hastanesi, Baltimore, Maryland.

Giderek, tıbbi uygulamada kullanılmaya başlandı yeni yöntem PCR kısaltmasına sahip bulaşıcı hastalıkların teşhisi. Bu araştırma yönteminin özü nedir ve bu sayede hangi hastalıkların tespit edilebileceği, diğer yaygın teşhis yöntemlerine kıyasla PCR'nin avantajları nelerdir ve analiz için nasıl uygun şekilde hazırlanacağını bu makaleyi okuyarak öğrenebilirsiniz. .

PCR nedir?

Kısaltma PCR, polimeraz zincir reaksiyonu anlamına gelir. Bu, bir DNA segmentinin ne zaman orantılı olarak çoğalma yeteneğidir? gerekli koşullar. Enfeksiyonların PCR teşhisi 1980'lerde icat edildi. Avrupalı, Amerikalı ve Sovyet bilim adamları keşif üzerinde çalıştı, bu nedenle yenilikçi teşhis yönteminin öncüsünü belirlemek mümkün değil. Ayrıca PCR gibi bulaşıcı hastalıkların araştırılmasına yönelik böyle bir yöntemin resmi olarak tescil edildiği 1983 yılından bu yana bu yöntemi geliştirmeye yönelik çalışmalar devam etmektedir. Günümüzde bu teşhis yöntemi, gerekli modern donanıma sahip hemen hemen her tıbbi laboratuvarda kullanılmaktadır.

Analiz nasıl yapılır?

PCR analizi için, bağlı olarak tıbbi endikasyonlar, kan, tükürük, idrar, meni, anne sütü veya genital salgılar, epitel hücreleri gibi materyallerden tıbbi numune alınması gerekir. PCR ile enfeksiyonların teşhisi, test materyalindeki patojenin DNA'sını tespit etmektir. Kimyasal reaktifler ve ekipman kullanan özel laboratuvar manipülasyonlarının yardımıyla, laboratuvar asistanları bir polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirir. Onun yardımıyla, patojenin DNA'sının mikroskopta görünmeyen bir kısmı, cihazda fark edilebilecek boyutlara kadar büyür. Bu nedenle, test materyalinde DNA'sının önemsiz bir bölümü olsa bile enfeksiyona neden olan ajanı tespit etmek mümkündür.

PCR ile hangi enfeksiyonlar saptanabilir?

Enfeksiyonların PCR teşhisi ile bir dizi patojenik mikroorganizmayı tespit edebilir. Sonuçların yorumlanması, patojenin saptanmasına ve türünün belirlenmesine indirgenmiştir. Teşhis için polimeraz zincir reaksiyonu kullanılır. çeşitli hastalıklar insan: cinsel yolla bulaşandan asemptomatik olana, sözde gizli enfeksiyonlar. PCR şunları bulur:

hepatit virüsü (A, B, C);
ureplasma urealiticum;
ureplasma parvum;
klamidya enfeksiyonları;
kandida
mikoplazma hominis;
mikoplazma genitalyumu;
garganella vajinalis;
trichomoniasis;
Tüberküloz;
herpes simpleks virüsü tip 1 ve 2;
papilloma virüsü;
Epshetain-Barr virüsü;
Helikobakter pilori;
immün yetmezlik virüsü.

Yukarıdaki mikroorganizmalar hepatit, tüberküloz, CYBE ve AIDS gibi hastalıklara neden olur.

Enfeksiyonların PCR teşhisi, kalitatif (yani, bir patojenin varlığı veya yokluğu belirlenir) ve kantitatif analiz (vücuttaki bir mikropun sayısı hesaplanır - bu yaklaşım gereklidir, örneğin, HIV enfeksiyonları ve hepatit tanısında).

Teşhis yönteminin avantajları

Günümüzde hemen hemen her laboratuvar insan enfeksiyonlarını polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak teşhis etmektedir. Bu yöntemin avantajları nelerdir, neden bu kadar kısa sürede hem hekimler hem de hastalar arasında inanılmaz popüler hale gelmiştir? Yenilikçi teknolojinin bu kadar hızlı yayılması, yüksek düzeyde güvenilirlik, verimlilik ve hassasiyetle açıklanmaktadır. PCR teşhis yönteminin avantajlarını daha ayrıntılı olarak ele alalım:

Analiz süreci mümkün olduğu kadar otomatikleştirilir, bu da çalışma ve sonucun yorumlanması sırasında insan faktörünü ortadan kaldırır.
Sayesinde modern teknolojiler kültürler 4-6 saat içinde ürer ve buna göre materyalin araştırmaya teslim edildiği gün analiz sonucunu alabilirsiniz.
Enfeksiyonların PCR teşhisi oldukça hassastır, bu da küçük bir DNA parçasının varlığında bile patojenin tespit edilmesini mümkün kılar. Bazı durumlarda, örneğin, halsiz ve asemptomatik hastalıklarda, mahsulleri başka bir yöntemle ekmek zordur veya tamamen imkansızdır.
PCR araştırması için materyal kan, tükürük, ürogenital salgılar, epitel hücreleri, idrar, meni olabilir ve bu, analiz için belirli materyalleri almanın imkansız olduğu durumlarda son derece uygundur. Bulaşıcı hastalıkların teşhisi için genellikle venöz kan ve ürogenital yayma kullanılır.
Polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi, aynı malzemeden birkaç patojeni tanımlayabilir. Bu yaklaşım yalnızca çözüm süresini azaltmakla kalmaz doğru teşhis aynı zamanda araştırma maliyetlerinden de tasarruf sağlar.
Yalnızca az sayıda yanlış negatif sonuç kaydedildiği için PCR yöntemi güvenilir kabul edilir. Bugüne kadar hiçbir yanlış pozitif yanıt kaydedilmemiştir.

PCR teşhisi ne zaman kullanılır?

Enfeksiyonların PCR teşhisinin avantajları ne olursa olsun, bu yöntem her zaman kullanılmaz. Örneğin, toksoplazmoz teşhisi konulurken, yalnızca ELISA analizi şüpheli veya tartışmalı bir sonuç gösterdiğinde bir polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilir. PCR yöntemini kullanarak hastalığın dinamiklerini izlemek imkansızdır. Not aşağıdaki durumlar bu araştırma yönteminin güvenilir ve etkili sonuçlar getireceği durumlarda:

yukarıda maddenin ilgili bölümünde belirtilen bulaşıcı hastalıkları belirlemek;
ürogenital enfeksiyonların yaygın PCR teşhisi;
hamilelik sırasında CYBE belirlemek için;
HIV teşhisi için;
tartışmalı tıbbi durumlarda bir ön teşhisi doğrulamak veya reddetmek;
babalık ve aile bağlarını belirlemek;
kalıtsal yatkınlıkları tespit etmek için genotiplemede kullanılır;
yardım eder PCR yöntemi adli tıp dairesi çalışanları genetik materyali tespit etmek için.

Hamilelik sırasında PCR

Cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların erken teşhisi amacıyla, kayıt yaptıran gebelerin PCR yöntemiyle muayene edilmesi zorunludur. Bu tür hastalıklar, çocuk doğurma döneminin normal seyri için son derece tehlikeli olduğundan. STI'ler fetal gelişimde solmaya, düşüklere, intrauterin deformitelere, ölü doğumlara, konjenital patolojilere neden olur. Enfeksiyonun zamanında tespiti ve tedavisi, hamileliğin olumlu sonuçlanma ve sağlıklı bir bebeğin doğum şansını önemli ölçüde artırır.

Genellikle anne adayı görevlendirilmiş Kapsamlı sınav, adı "PCR 6" olan. Böyle bir çalışma 6 farklı enfeksiyonun analizini içerir. PCR teşhisi hem kamu hem de özel kurumlarda yapılmaktadır: Invitro, Happy Family, Uro-Pro ve diğer laboratuvarlar bu hizmeti vermektedir. Bu sorun aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Bu nedenle, materyali analiz için yalnızca bir kez almak gerekli olacaktır. Hamilelik sırasında PCR teşhisi yapılırken, jinekolojik bir fırça ile servikal kanaldan alınan bir ürogenital sürüntü gereklidir. Bu prosedür ağrı hamile bir kadında ve fetüsü hiçbir şekilde etkilemez.

Hepatit belirlemek için PCR

PCR teşhisi genellikle hepatite neden olan ajanı tespit etmek için reçete edilir. Bu, böyle bir hastalığın genellikle asemptomatik olması ve kronik, şiddetli, inatçı bir aşamaya geçmesiyle açıklanmaktadır. PCR yardımıyla, hepatit en erken aşamalarda tespit edilir ve bu da mümkün olan en kısa sürede uygun bir tedaviye katkıda bulunur. Enfeksiyonların bu tür PCR teşhisi çoğu özel laboratuvarda gerçekleştirilir. Fiyat, tespit edilen virüs tipine ve analiz tipine bağlıdır. Bu nedenle, kanda patojen DNA'nın varlığının veya yokluğunun basit bir tespiti 400-600 rubleye mal olur. Kantitatif yöntem 1200-1500 rubleye mal olacak.

Kapsamlı PCR çalışması

PCR yönteminin bulaşıcı hastalıkların teşhisinde daha da etkin olması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kapsamlı çalışma, tanı ve zamanında tedavi süresini azaltmaya yardımcı olur. Bu nedenle laboratuvarlar "PCR-6" ve "PCR-12" analizlerini sunmaktadır. İlk kompleks, aşağıdakiler gibi genital enfeksiyonların PCR teşhisini içerir:

üroplazmoz;
klamidya;
mikoplazmoz;
insan papilloma virüsü;
basit uçuk;
sitomegalovirüs.

Böyle bir çalışma genellikle kadınlara atanır. erken tarihler hamilelik ve gebe kalmanın planlanması sırasında.

"PCR-12" sırasında yukarıdaki hastalıklara ek olarak aşağıdakiler teşhis edilir:

belsoğukluğu;
kandidiyazis;
bakteriyel vajinoz;
trichomoniasis;
üroplazmoz;
uçuk 1 ve 2 türleri.

Laboratuvara bağlı olarak, komplekste yer alan incelenen hastalıkların listesi değişebilir. Doktor her birini seçecek özel durum en uygun muayene. Her durumda, PCR ile kapsamlı bir analiz çok daha az zaman, çaba ve malzeme maliyeti alacaktır.

Enfeksiyonların PCR teşhisi: nasıl geçilir?

PCR analizi için hazırlık, belirli bir materyal türünün toplanmasına yönelik tavsiyelerin izlenmesinden oluşur:

Bir ürogenital smear geçerken, önerilen analizden üç gün önce cinsel temastan kaçınmalısınız, almayı bırakmalısınız. antibakteriyel ilaçlar ve yerel merhemler, kremler, fitiller, duş prosedürünü gerçekleştirmek imkansızdır. Adet akışı sırasında, materyal örneklemesi yapılmaz - adetin bitiminden en geç 3 gün sonra bir analiz yapılması gerekir. Analizden 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmalısınız.
Sabahları aç karnına venöz kan bağışlamak daha iyidir (bu kural olmasa da). Bir gün öncesinden alkol ve yağlı yiyeceklerin tüketimini sınırlandırmalısınız.
Sperm bağışlarken üç gün boyunca cinsel temastan kaçınmalısınız. Alkol kullanımını sınırlamanız, saunayı ziyaret etmeniz, sıcak bir banyo yapmanız önerilir.
İdrar, cinsel organların iyice yıkanmasından sonra sabah alınmalıdır. Malzemeyi özel steril bir kapta toplamak daha iyidir. Materyal birkaç saat içinde laboratuvara teslim edilmelidir.

Sonuç nasıl çözülür?

Enfeksiyonların PCR teşhisi yapıldıktan sonra sonuçları yorumlamak zor değildir. Kalitatif yöntemin deşifre edilmesi, test materyalinde bir patojenin varlığının veya yokluğunun değerlendirilmesinin yanı sıra patojenik mikroorganizma tipinin belirlenmesinden oluşur. Test materyalinde bir mikrobun DNA'sının bir kısmı bulunursa, pozitif sonuç ilgili forma kaydedilir ve hangi mikrop tipinin belirlendiği de belirtilir. Malzemede patojen bir mikroorganizma bulunmaması durumunda sonuç negatif olacaktır.

Örneğin hepatit tanısında kantitatif bir analizin sonuçları, laboratuvar tarafından belirlenen standartlar kullanılarak deşifre edilmelidir. Ölçüm birimleri ve niceliksel faktör, farklı tıbbi teşhis kurumlarında önemli ölçüde farklılık gösterdiğinden. Güvenilir bir şekilde, eşlik eden tüm faktörleri hesaba katarak, böyle bir analizi yalnızca bir doktor deşifre edebilir.

PCR yöntemi (polimeraz zincir reaksiyonu), son derece hassas bir moleküler biyoloji yöntemi olan modern DNA teşhisinin "altın standardı" dır. tıp, genetik, adli tıp ve diğer alanlarda kullanılmaktadır. Birçok bulaşıcı hastalığın teşhisinde sıklıkla ve başarıyla kullanılmaktadır.

PCR ile bulaşıcı hastalıkların teşhisi

PCR ile yapılan çalışma, test materyalinde yalnızca patojenin kendisini değil, tek bir yabancı DNA parçasını bile tespit etmenizi sağlar. Araştırılan (biyolojik) materyal: oksijensiz kan, epitel hücreleri ve genital sistemin salgıları, meni, tükürük, balgam ve diğer biyolojik salgılar. Gerekli biyolojik materyal şüphelenilen hastalığa göre belirlenir.

Zamanımızdaki PCR yöntemi elbette güçlü bir teşhis aracıdır. Belki de çalışmanın tek dezavantajı yüksek fiyatıdır.

Varlığı PCR ile belirlenebilen hastalıklar listesinde şunlar vardır:

viral ve bakteriyel pnömoni;
tüberküloz;
kızamık, kızamıkçık, kabakulak;
her türden enfeksiyöz hepatit;
salmonelloz, difteri;
Helicobacteriosis ve neden olduğu hastalıklar bağırsak enfeksiyonları;
STD'ler (cinsel yolla bulaşan hastalıklar): gonore, klamidya, ureaplasmosis, sifiliz, AIDS, genital herpes, gardnerelloz ve diğerleri.

PCR ile CYBE muayenesi

Geleneksel testlerden farklı olarak, PCR tekniği cinsel yolla bulaşan enfeksiyonları (CYBE) belirtileri olmasa bile tespit edebilir. Biyolojik materyali almak için, kadınlar servikal kanalın epitel hücrelerini, erkekler için - üretranın kazımasını yaparlar. Gerekirse, venöz kanı incelemek için PCR kullanılır.

Böylece, CYBE'ler için PCR testi şunları belirlemeyi mümkün kılar:

insan immün yetmezlik virüsü (HIV);
soluk treponema (frengi etkeni);
herpes simpleks virüsü ve sitomegalovirüs;
insan papilloma virüsü (HPV);
klamidya, toksoplazma, mikoplazma, ürelazma ve diğer cinsel enfeksiyonlar.

PCR analizinin doğru yapılması koşuluyla yanlış pozitif sonuç olasılığı ortadan kalkar. Ayrı olarak, insan papilloma virüsünden (HPV) ve bunun teşhisi için PCR yönteminin öneminden bahsedilmelidir. Onkositolojik yaymanın aksine, PCR, varlığı bir kadını şu kadar ciddi ve genellikle ölümcül bir hastalıkla tehdit eden belirli bir HPV tipini, özellikle onkojenik tipleri 16 ve 18'i belirleyebilir. Onkojenik HPV tiplerinin PCR ile zamanında tespiti, genellikle rahim ağzı kanseri gelişimini önlemeyi mümkün kılar.

Enzim immunoassay (ELISA) ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR): artıları ve eksileri

Hangi teşhis yöntemi daha iyidir: PCR veya ELISA? Bu sorunun doğru bir cevabı yoktur, çünkü özünde bu iki çalışma kullanılarak teşhisin farklı amaçları vardır. Ayrıca ELISA ve PCR yöntemleri daha çok birlikte kullanılmaktadır.

Enfeksiyonun spesifik nedensel ajanını belirlemek için bir PCR çalışması gereklidir, hastalığın semptomatik belirtileri olmamasına rağmen enfeksiyondan hemen sonra tespit edilebilir. Bu yöntem gizli ve kronik bakteriyel ve viral enfeksiyonlar.Yardımı ile birkaç patojen aynı anda tespit edilebilir ve terapi sırasında PCR yöntemi, yabancı DNA'nın kopya sayısını belirleyerek kalitesini değerlendirmenize olanak tanır.

PCR tekniğinden farklı olarak ELISA yöntemi, enfeksiyöz ajanın kendisini değil, vücudun buna karşı bağışıklık tepkisini tespit etmek, yani belirli bir patojene karşı antikorların varlığını ve miktarını belirlemek için tasarlanmıştır. Tespit edilen antikorların türüne (IgM, IgA, IgG) bağlı olarak, bulaşıcı sürecin gelişim aşamasını belirlemek mümkündür.

Her iki yöntem de, PCR ve ELISA oldukça güvenilirdir (sırasıyla %100 ve %90). Ancak, bazı durumlarda ELISA analizinin yanlış pozitif (kişi geçmişte belirli bir hastalık geçirmişse) veya yanlış negatif (enfeksiyon nispeten yakın zamanda geçmişse) sonuç verdiğine dikkat etmek önemlidir.

Günümüzde PCR analizi, çeşitli bulaşıcı hastalıkların teşhisinde en güvenilir yöntemlerden biri olarak kabul edilmektedir. Ek olarak, yöntem daha erişilebilir hale geliyor. Yüksek özgüllük düzeyi nedeniyle, yanlış sonuçlar elde etme olasılığı ortadan kaldırılmıştır.

Analiz metodolojisi

Analiz sırasında test malzemesi özel bir cihaza yerleştirilir. Genetik materyalin oluşumunda yer alan enzimleri ekleyin. Ayrıca, patojenin DNA veya RNA'sının tekrar tekrar kopyalanması meydana gelir. Döngüden döngüye, DNA kopyalarının sayısı, patojeni tanımlamanın kolay olduğu bir miktara yükselir.

PCR kan testi en yaygın olarak kullanılan klinik uygulama hastalığın bulaşıcı nedenini belirlemek için. Ayrıca idrar, farinksten bir sürüntü ve diğerlerini incelemek de mümkündür. biyolojik malzemeler. Kadınlarda PCR analizi için genital organlardan alınan salgılar kullanılır, servikal kanal. Aynı zamanda, sonucun olabildiğince güvenilir olması için kadınlarda PCR analizine nasıl hazırlanılacağını bilmek önemlidir. Ana şey aşağıdaki kurallara uymaktır:

testten üç gün önce cinsel ilişkiden uzak durmak;
çoğu bakteriler idrarda "yıkanabilir", bu nedenle çalışmadan önce idrara çıkmamalısınız;
Menstruasyondan hemen sonra bir çalışma yapmayın, bittikten sonra 3-5 gün beklemeniz gerekir.

Kan tahlili öncesi özel bir hazırlık yoktur.

PCR - analiz ne gösteriyor?

PCR analizinin çeşitli viral ve Bakteriyel enfeksiyonlar. Bu yöntem aynı zamanda gizli, kronik enfeksiyonların saptanmasında da etkilidir. CYBE'ler için PCR analizi, virüs ve bakterilerin tek hücrelerinin varlığında bile patojenik bir ajanın izole edilmesini mümkün kılar. Genital enfeksiyonlar bloğunda hangi PCR testlerinin yer aldığını belirtmekte fayda var, bunlar:

klamidya;
ürelazmalar (parvum ve urealiticum);
gonore etken maddesi;
Çeşitli tipler insan papilloma virüsü;
trikomonas;
bahçıvan;
kandida

Genital organların bulaşıcı hastalıklarında, PCR materyali servikal kanal, üretra ve vajinadan alınan bir yaymadır. Gebelik hazırlığına büyük bir sorumlulukla yaklaşılmalıdır. Hamileliği planlarken, en yaygın şüphelerin olduğu durumlarda PCR testleri gereklidir. bulaşıcı hastalıklar. Ve enfeksiyon varlığında hamileliği ertelemek daha iyidir. Yukarıdaki patojenleri belirlemeye yönelik testlerin sadece bir kadına değil bir erkeğe de yapılması gerektiğini belirtmekte fayda var.

Ayrıca, PCR yöntemi aşağıdaki patojenleri tanımlamanıza izin verir:

hepatit B ve C virüsleri;
Tüberküloz;
Epstein-Barr virüsü ve sitomegalovirüs dahil herpes ailesi virüsleri;
helikobakter enfeksiyonu.

Sonuçların yorumlanması

PCR analizinin deşifre edilmesi zor değildir. Tipik olarak, PCR analizlerinin sonuçları aşağıdaki gibi elde edilebilir:

Bazı durumlarda, mikroorganizmaların kantitatif tayini yapılır. Bu, özellikle fırsatçı patojenlerin neden olduğu hastalıklar için geçerlidir. Çünkü bu bakteriler olumsuz etkilerini ancak fazla olduklarında gösterirler. Ayrıca terapötik taktiklerin seçimi ve HIV ve hepatit virüsleri gibi viral enfeksiyonların tedavisinin izlenmesi amacıyla kantitatif PCR analizi önemlidir.