Šta je pcr studija. Kako prikupiti biomaterijal za dijagnostiku

dr.sc. Pokrovskaya M.S.,
dopisni član RAMN, prof. Smirnov G.B.
(NIIEM nazvan po N.F. Gamaleyi iz Ruske akademije medicinskih nauka i JSC "LAGIS")

Uvod

Odavno je poznato da da biste izliječili pacijenta, morate znati od čega je tačno bolestan. Proces utvrđivanja vrste bolesti naziva se dijagnoza. Dijagnozu za bilo koju bolest postavlja liječnik (na osnovu proučavanja anamneze, opservacije kliničke manifestacije i analizu podataka laboratorijska istraživanja), nakon čega propisuje liječenje. Danas, prilikom postavljanja dijagnoze, doktor koristi laboratorijske podatke, bez kojih je teško ili u nekim slučajevima nemoguće postaviti ispravnu dijagnozu.

Značaj dijagnoze kao procesa prepoznavanja bolesti leži u činjenici da je rana, tačna dijagnoza osnova za racionalnu i efikasnu terapiju, omogućava u većini slučajeva predviđanje moguće opcije dalji tok i ishod bolesti.

U dijagnostici zaraznih bolesti, uklj. STD-ove je važno identifikovati etiološki faktor(uzročnik) i ustanoviti stadijum bolesti, odnosno dobiti informacije potrebne za izbor etiotropne i adekvatne terapije, predvideti tok bolesti i vreme njenog završetka.

Karakteristike savremene laboratorijske dijagnostike su stalni razvoj novih i unapređenje poznatih metoda i tehnika. To je zbog činjenice da se posljednjih decenija kontinuirano mijenja kako kliničku sliku zarazne bolesti i karakteristike njihove patogeneze. Na primjer, dobro poznati prilično opasni patogeni mogu uzrokovati izbrisane oblike bolesti, ili obrnuto: oportunistički ili nepatogeni mikroorganizmi uzrokuju teške oblike. Tropizam patogenih mikroorganizama se mijenja (utječu na druge organe i tkiva) i kao rezultat toga pojavljuju se novi oblici zaraznih procesa. Javljaju se kronični, perzistentni oblici infekcija i mijenja se antigena struktura patogena, mikroorganizmi prelaze u nekultivirano stanje. Odstupanja od klasičnih oblika tijeka zaraznih bolesti i pojava atipičnih oblika povezuju se s dvije okolnosti. Prvo, kod dijela populacije se promijenilo stanje imunološkog sistema, učestala su stanja imunodeficijencije različite prirode. Drugo, sami patogeni se mijenjaju. Odnosno, svjedoci smo evolucijskog procesa kod mikroorganizama.

Sve ovo komplikuje dijagnozu i negativno utiče na efikasnost lečenja. Uloga upotrebe savremenim metodama laboratorijska istraživanja za dijagnozu sada postaju veoma značajna.

Za dijagnostiku zaraznih bolesti koriste se različite laboratorijske i instrumentalne metode, među kojima najznačajnije mjesto zauzimaju specifične metode koje za cilj imaju identifikaciju uzročnika bolesti i na taj način utvrđivanje etiološke dijagnoze.

Predmet ovog priopćenja su odabrani dijelovi laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti.

Osnovni pojmovi i metode laboratorijske dijagnostike infekcija

Ključni pokazatelji laboratorijske dijagnostike su osjetljivost i specifičnost metoda za otkrivanje infektivnih uzročnika (gljivice, protozoe, bakterije i virusi).

Osjetljivost- Ovo minimalni iznos materijal koji se može otkriti ovom metodom. Materijal mogu biti cijeli mikroorganizmi i fragmenti molekula patogena, kao i specifična antitijela koja ljudsko tijelo proizvodi kao odgovor na infekciju. Što manje materijala metoda može otkriti, to je veća njena osjetljivost. Ako laboratorijska studija ne otkrije mikroorganizme koji su prisutni u uzorku i za čiju detekciju je razvijen test sistem, rezultat se naziva lažno negativan. Što je veća osjetljivost metode, to je manje lažno negativnih [lažno (-)] rezultata.
Specifičnost- ovo je sposobnost metode da ukaže na prisustvo u uzorku samo objekta za čiju detekciju je razvijen test sistem. Ako metoda ukazuje na prisustvo mikroorganizama u uzorku koji se tamo ne nalaze, rezultat se naziva lažno pozitivan. Što je veća specifičnost metode, to je manje lažno pozitivnih [lažno (+)] rezultata.
Sve metode laboratorijske dijagnostike mogu se podijeliti u dvije grupe: metode direktne i indirektne detekcije mikroorganizama.

Direktne metode tako nazvani jer direktno otkrivaju infektivne agense ili materijal koji je dio patogena, ili ga proizvodi. Obično su to antigeni ili genetski materijal. Direktne metode uključuju sljedeće (tabela 1):

Tabela 1. Direktne metode laboratorijske dijagnostike
Metode	Princip metode	Specifičnost	Osjetljivost
Mikrobiološka	Izolacija čiste kulture patogena	100% "zlatni standard" laboratorijske dijagnostike	1000-10000 ćelija/ml
citološki (mikroskopija)	Pregled obojenih mrlja	20-80%	1.000-100.000 ćelija/ml
Imunocitološki i serološki	Detekcija antigena nakon vezivanja za antitela RIF, ELISA	70-90%	1.000-100.000 ćelija/ml
Molecular biological	Određivanje specifične DNK/RNA regije u genomu patogena	99-100% je jednako "zlatnom standardu"	200 ćelija/ml (1 ćelija po reakciji)

Lažni (+) rezultati su povezani u slučaju citološke metode sa subjektivnošću evaluacije rezultata, u slučaju imunoloških metoda - sa unakrsnom reakcijom antigena sa antitelima.

Lažni (-) rezultati u direktnim metodama mogu biti zbog nedostupnosti patogena tokom uzorkovanja kliničkog materijala, za mikrobiološku metodu - smrt mikroorganizma tokom transporta uzorka i u slučaju nekulturnog oblika .

Indirektne metode nazvane tako jer otkrivaju materijal ne samog patogena, već specifična antitijela koje osoba proizvodi kao odgovor na infekciju ovog tipa, tj. su imunološki. Ove metode uključuju: reakciju vezivanja komplementa (RCC), reakciju indirektne imunofluorescencije (RNIF), reakciju mikroimunofluorescencije (MIF), rekombinantni lipopolisaharid ELISA (r - ELISA), enzimski imunotest (ELISA). Osetljivost ovih metoda je 1000-100000 ćelija/ml.
Kod primjene imunoloških metoda, u gotovo svim slučajevima, lažni (+) rezultati su povezani s nespecifičnim vezivanjem antitijela na antigene ili unakrsnom reakcijom antigena s antitijelima. Lažni (-) rezultati nastaju zbog nedovoljne količine specifičnih antitijela ili antigena u uzorku i nedovoljne osjetljivosti metoda detekcije.

Uprkos značajnom napretku u modernom laboratorijska dijagnostika nijedna metoda u praksi ne garantuje kombinaciju 100% osjetljivosti i specifičnosti. Dakle, ne daje 100% tačan odgovor. Stoga, da bi postavio dijagnozu, liječnik često mora koristiti najmanje dva drugačija metoda, a svaku studiju je najbolje raditi u dva ili tri ponavljanja. Ovo je uslov u dijagnostici bolesti kao što su tuberkuloza, klamidija i niz drugih (1).

Dijagnostička vrijednost detekcije imunoglobulina klasa A, M, G

Zaustavimo se detaljnije na serološkoj dijagnostici (određivanje antitijela u krvnom serumu ELISA-om). Zasnovan je na određivanju vrlo specifičnih antitijela (AT) koja nastaju u ljudskom tijelu kao odgovor na prisustvo infektivnih mikroorganizama. Ova antitela su imunoglobulini (Ig) klase M, A, G. Antitela neutrališu infektivne agense interakcijom sa antigenima. Antigen je specifičan dio infektivnog agensa (mikroorganizma) koji uzrokuje stvaranje specifičnih antitijela u ljudskom tijelu (imuni odgovor). Osnova seroloških reakcija je specifična interakcija antigen-antitijelo. Razmotrimo šta otkrivanje antitijela klasa IgM, IgA, IgG daje za postavljanje dijagnoze (tabela 2).

Tabela 2. Određivanje stadijuma zarazne bolesti na osnovu rezultata ispitivanja antitijela u krvnom serumu ELISA-om
Stadijum (oblik) bolesti	Antitijela po redoslijedu pojavljivanja u serumu	Dinamika titara (u rasponu od 2-3 sedmice)
Akutno sa primarnom infekcijom	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA ili - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ rani ili rani rani IgG	Povećanje ili smanjenje titra (IgM nakon 7. dana), ovisno o vremenu proteklom od početka infekcije
Sekundarna infekcija i reaktivacija (relaps)	IgG ⇒ IgA, skoro da nema IgM ⇒ rani ili rani rani IgG	Brzi porast ili pad titra
Hronični	IgG ⇒ IgA, ponekad samo IgA ili samo IgG	Konstantno niski titri, mogu biti konstantno visoki - u slučaju teške uzlazne infekcije ili sistemskih lezija.
upornost, nosivost	IgA ili IgG	Konstantni (nekoliko sedmica) niski titri (antitijela se ne otkrivaju uvijek zbog izmijenjene antigenske strukture mikroorganizama)
dugotrajna bolest	IgG	Konzistentno niski titri

Kvantitativno određivanje antitijela različitih klasa pomaže u određivanju stadija i prirode toka bolesti. Prilikom tumačenja kvantitativnih rezultata, mora se uzeti u obzir da je imunološki odgovor ljudsko tijelo o razvoju infekcije i nivou antitijela koje ona proizvodi ovise o karakteristikama patogena, stadiju infektivnog procesa i individualne karakteristike imunog sistema. U slučaju teške imunosupresije, sinteza AT može biti potpuno potisnuta. Stoga, za postavljanje dijagnoze, posebno kod atipičnih oblika infekcija, liječnik ne može jednoznačno protumačiti kvantitativni rezultat jedne studije.

Za ispravnu procjenu rezultata kvantitativne detekcije antitijela na različite infektivne agense potrebno je koristiti princip uparenih seruma (ponoviti studiju nakon 2-3 sedmice i uporediti rezultate). Takve studije omogućavaju analizu dinamike otkrivanja antitijela i na taj način dobivanje potrebnih informacija o razvoju zaraznog procesa. Četvorostruko povećanje antitela za 2-3 nedelje ukazuje na razvoj infekcije.

Kvantitativni rezultati ELISA-e potrebni su upravo da bi se mogle provesti takve uparene studije.

Tradicionalni način definisanja akutna infekcija- Detekcija IgM u krvnom serumu. Savremeni dijagnostički test sistemi omogućavaju otkrivanje, pored IgM, i drugih ranih antitela, kao što su: 1) IgG na neposredne rane proteine virusa i 2) niskoavidni IgG. Štoviše, IgG za rane ranljive proteine virusa su markeri i primarne akutne infekcije i relapsa (pogoršanja kronične infekcije) i reinfekcije, tj. sve varijante akutne infekcije, za razliku od IgM, koji se u pravilu proizvode samo tijekom primarne infekcije.

lančana reakcija polimeraze

Uvođenje molekularnih dijagnostičkih metoda u praksu medicinske mikrobiologije bio je, naravno, značajan događaj, jer su radikalno proširile mogućnosti proučavanja patogeneze bolesti, temeljno poboljšale dijagnostiku, pa čak i zacrtale nove pristupe liječenju. Metoda molekularne dijagnostike bazirana na PCR-u, koja daje optimalnu kombinaciju visoke osjetljivosti i specifičnosti, postaje sve češća.

Molekularna dijagnostika, općenito, a posebno PCR, zasnivaju se na određivanju prisustva specifičnih nukleinskih kiselina u uzorku testa, najčešće DNK.

DNK je dvolančana (dvolančana) polimerna molekula, sekvenca nukleotida u kojoj određuje sva svojstva organizma. Kada se ćelije podijele, DNK se udvostručuje i svaka od dvije kćerke ćelije dobija tačnu kopiju genetskog materijala roditeljske ćelije. Duplikacija molekula DNK naziva se replikacija. Na dva inicijalna (matrična) lanca DNK grade se novi lanci kćeri (komplementarni matrici). Replikaciju osigurava enzimski kompleks, čiji je ključni element DNK polimeraza. Da bi DNK polimeraza mogla započeti replikaciju, osim šablona, potreban joj je prajmer (primer) - mali fragment DNK komplementarno povezan sa šablonom. DNK polimeraza, takoreći, produžava ovo sjeme izgradnjom novog DNK lanca na postojećem šablonu. Obično se sva DNK u ćeliji ili virusu replicira u prirodi, a proizvod ovog procesa su dvije identične kopije originalne DNK.

Sada kada smo se ukratko prisjetili najvažnije stvari o replikaciji, možemo prijeći na opisivanje lančane reakcije polimeraze. PCR je otkriven 1983. godine i trenutno se široko koristi za naučna i praktična istraživanja, u oblasti dijagnostike infektivnih i genetskih bolesti, rana dijagnoza neke onkološke patologije. Za otkriće ove metode, Cary Mullis je 1995. godine dobio najprestižniju naučnu nagradu - Nobelovu nagradu.

Tokom ove reakcije, DNK se takođe replicira, ali ne na uobičajen način u prirodi. Prvo, ne replicira se cela DNK mikroorganizma, već samo njen mali fragment (meta).

Drugo, PCR proizvod nije dva, već milioni kopija originalne mete. Ova ponovljena replikacija se naziva amplifikacija.

Različiti rodovi i vrste bakterija, kao i virusi, imaju različite genetske tekstove (nukleotidne sekvence DNK). Savremeni kompjuterski programi sadrže bazu podataka dešifrovanih sekvenci DNK različitih organizama. Prilikom razvoja dijagnostičkog PCR test sistema, nalazi se mali fragment DNK (meta) koji je striktno specifičan za određeni patogen. To je ovo područje koje se amplificira PCR-om, a zatim se proizvod amplifikacije (amplikon) identificira elektroforezom u agaroznom gelu.

Identificiranjem fragmenta DNK specifičnog za dati mikroorganizam, mikroorganizam se na taj način određuje.

Svaki ciklus dijagnostike infekcija odvija se u tri faze (sl.):

Denaturacija - odmotavanje dvolančanih DNK lanaca - nije enzimski proces koji se odvija na temperaturi od 95 0 C.
Pričvršćivanje (žarenje) prajmera. Za početak procesa replikacije u PCR-u koriste se prajmeri - kratka jednolančana DNK (dužina 15-30 baza), koji se u višku dodaju u reakcionu smjesu. Oni se posebno (prema principu komplementarnog uparivanja) pričvršćuju na kratke dijelove koji ograničavaju odabranu metu. Ova faza nije enzimska i odvija se tokom inkubacije reakcione smeše na 55-65 0 C. Prajmeri su vezani samo za odabrane DNK fragmente specifične za ovaj patogen i ne stupaju u interakciju sa bilo kojom drugom sekvencom DNK i raznim mikroorganizmima). To je ono što osigurava apsolutnu specifičnost dijagnostičkog PCR test sistema. Višak DNK prajmera u odnosu na šablon DNK obezbeđuje visoku osetljivost metode. To jest, prajmeri u početnom PCR rastvoru sa 100% verovatnoćom će pronaći metu za pričvršćivanje.
Kao rezultat dodavanja prajmera, formiraju se strukture [DNK šablon + prajmer], koje su "semenski" kompleksi. Završetak prajmera počinje, počevši od 3'-krajeva, komplementarnom sintezom na šablonima jednolančanih fragmenata DNK. Ovaj proces se provodi uz pomoć posebnog enzima - Taq polimeraze (termostabilna DNK polimeraza) i nukleotida (kao građevinskog materijala).
Novosintetizovana dvolančana DNK nakon koraka denaturacije ponovo vezuje prajmere koji su u višku u smeši. Rezultirajuće strukture nakon završetka formiraju specifične fragmente DNK ograničene prajmer sekvencama. Dakle, čak i ako je samo jedan molekul DNK bio početni za PCR, onda se amplifikacija dešava unutar 25-40 ciklusa, tj. sintetizovano veliki broj(108-109 kopija) specifičnih DNK fragmenata (amplikona), dovoljnih za vizualno snimanje rezultata reakcije nakon elektroforeze u agaroznom gelu.

PCR se provodi u ciklatoru ili biciklista- uređaj u kojem se navedeni način promjene temperature automatski izvodi ciklično, što vam omogućava da uzastopno prođete 1, 2, 3 stupnja.

Obračun reakcije se provodi pomoću elektroforeze u agaroznom gelu. Negativno nabijene molekule DNK kreću se u gelu pod djelovanjem električnog polja od katode do anode, dok dužina kretanja fragmenata DNK u određenom vremenskom periodu ovisi o njihovoj veličini. DNK u gelu je obojen etidij bromidom, što ga čini vidljivim pod ultraljubičastim svjetlom. Ako su se amplikoni (fragmenti DNK iste veličine) nakupili u test uzorku kao rezultat PCR-a, tada će biti na istoj udaljenosti od početka i bit će vidljivi kao traka na tragu gela. Ako pozicija trake na tragu gela odgovara izračunatom za par prajmera koji se koristi, tj. je na istoj udaljenosti od starta kao i pojas pozitivne kontrole, to znači da je rezultat studije pozitivan.

Kao iu svakom eksperimentu, kada se uzmu u obzir rezultati PCR-a, daju se kontrole - pozitivne i negativne. Svaki dijagnostički test sistem mora imati odobren propis, koji uključuje prisustvo navedenih kontrola.

Pozitivna kontrola je uzorak sa DNK šablonom za akumulaciju specifičnog amplikona koji odgovara mikroorganizmu koji se utvrđuje.

Negativna kontrola - voda, ljudska DNK ili DNK mikroorganizama usko srodnih onoj koja je određena ovim test sistemom.

Prednosti PCR metode

PCR dijagnostika je jedna od najmodernijih i najnaprednijih laboratorijskih dijagnostičkih metoda koja omogućava specifično otkrivanje DNK pojedinačnih ćelija patogena zaraznih bolesti u uzorku.

Postoji fundamentalna razlika između metoda molekularne dijagnostike, uključujući PCR, i bilo koje druge tradicionalne metode. Ova razlika je to tradicionalne metode otkrivaju produkte aktivnosti gena mikroorganizama (proteini, antigeni i složenije organizovane karakteristike), dok PCR direktno otkriva genetski materijal. Dakle, mikroorganizam se otkriva PCR-om, bez obzira na karakteristike funkcioniranja genoma, bilo kakve atipične manifestacije.

Možemo reći da PCR dostiže maksimalnu moguću osjetljivost. Osetljivost PCR test sistema je 10-1000 ćelija po uzorku, dok je osetljivost imunoloških i mikroskopskih metoda 1000-100000 ćelija po uzorku. Zbog svoje visoke osjetljivosti, test sistemi bazirani na PCR-u su nezamjenjivi u slučajevima kada je materijal koji se proučava (uzročnik) vrlo mali.

Zbog svoje visoke osjetljivosti, PCR test omogućava ranu dijagnozu bolesti (npr preventivni pregledi stanovništva), razjasniti dijagnozu na pozadini antibiotske terapije, provjeriti izlječenje (efikasnost liječenja), a također otkriti perzistentne mikroorganizme. Za neke patogene kao što su Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, osjetljivost dijagnostičkih PCR test sistema ne bi trebala biti visoka. Indikatori osjetljivosti su posebno razvijeni i odobreni, počevši od 105-6 ćelija po ml. Takvi test sistemi otkrivaju dijagnostički značajan broj ovih mikroorganizama (2,3).

U otkrivanju teško kultiviranih, nekultiviranih i perzistentnih oblika patogenih mikroorganizama samo direktna metoda kojom se otkriva DNK patogena daje neophodan dijagnostički odgovor. Druge dijagnostičke metode (imunološke, bakteriološke, mikroskopske) su teške ili čak nemoguće. U slučaju perzistentnih mikroorganizama, to može biti posljedica promjena u antigenskoj strukturi patogena ili prijelaza takvih mikroorganizama u nekultivirani oblik. Ovo se mora imati na umu prilikom dijagnosticiranja latentnih i kroničnih infekcija.

Visoka specifičnost PCR metode određena je nukleotidnom sekvencom prajmera i uslovima za njihovo vezivanje za specifični DNK fragment (cilj) striktno za ovaj patogen. U zavisnosti od odabranih prajmera, PCR test sistem može razlikovati rodove, vrste, serotipove, pa čak i patogene i nepatogene sojeve mikroorganizama iste vrste.

Koristeći PCR za dijagnosticiranje infekcija, moguće je odrediti osjetljivost (ili rezistenciju) patogena na mnoge od korištenih antibiotika. Ovo se posebno odnosi na slučajeve kada se mikrobiološka metoda istraživanja ne može primijeniti.

Za PCR analizu pogodan je svaki klinički materijal koji potencijalno sadrži infektivne agense - krv, serum, tekućina za ispiranje, ispljuvak, pljuvačka, želudačni sok, materijal za biopsiju, razmaz, ispiranje. Proučavani materijal mogu biti uzorci iz objekata okoline (isprani, otisci, mrlje, voda, tlo, itd.).

PCR je objedinjena i automatizovana metoda, koja omogućava standardnu usklađenost sa propisima odobrenim u dozvolama za korišćenje ovog PCR test sistema i obezbeđuje visoku tačnost i ponovljivost rezultata.

Laboratorijska dijagnostika PCR-om - brza i pouzdan način otkrivanje uzročnika zaraznih bolesti. PCR laboratorija daje odgovor u roku od 48 sati od trenutka dostavljanja materijala u studiju. (Neto vrijeme ispitivanja za svaki uzorak je samo nekoliko sati.)

Više od 20 patogena može se istovremeno odrediti u jednom kliničkom uzorku.

Važan aspekt pri provođenju studije kliničkog uzorka je usklađenost sa pravila za sakupljanje i skladištenje kliničkog materijala. Evo samo nekih općih preporuka:

Uzorkovanje kliničkog materijala vrši se iz očekivanog staništa mikroorganizama i razvoja infekcije (za to je potrebno uzeti u obzir ulazna vrata, puteve distribucije, mjesta razmnožavanja i načine izolacije željenih mikroorganizama).
Količina pražnjenja u uzetom materijalu trebala bi biti mala (ne više od "veličine glave šibice"). Višak izlučevina, sluzi i gnoja negativno utiču na kvalitet ekstrakcije DNK i doprinose degradaciji DNK tokom skladištenja i transporta.
Za uzimanje uzoraka kliničkog materijala potrebno je koristiti samo jednokratne četke ili briseve. Prilikom unošenja kliničkog materijala u laboratorijsku epruvetu s otopinom, pazite na sterilnost.

Relevantnost molekularne dijagnostike

Jedan od najupečatljivijih primjera koji pokazuje važnost molekularne dijagnostike je otkrivanje visoke onkogene rizične infekcije papiloma virusom. Ne izazivaju svi papiloma virusi maligni rast. Postoje genotipovi virusa za koje postoji velika vjerovatnoća da će uzrokovati rak i takozvani benigni genotipovi. Prvi uključuju genotipove 16, 18 (česti u našim krajevima), 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 ( P291) i MM9 (P238A). Genotipovi 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66 i MM8 (P155) se smatraju benignim. Identifikacija genotipa papiloma virusa je moguća i provodi se pomoću PCR (4,5).

Papiloma virus tipovi 16,18 perzistira u ćelijama skvamoznog epitela grlića materice, ne izazivajući kliničke manifestacije godinama (do 5 godina period inkubacije), do formiranja uočljive neoplazije. Rana dijagnoza u takvim slučajevima moguća je samo uz preventivne preglede stanovništva primjenom PCR-a. U slučaju otkrivanja DNK tipova papiloma virusa za koje postoji velika vjerovatnoća da uzrokuju rak, pacijent se treba obratiti onkologu, posjetiti ga jednom mjesečno, pratiti kliničke manifestacije. Dakle, PCR u ovom slučaju omogućava ranu dijagnozu, što omogućava prevenciju ili ne početak raka grlića materice.

U određenom broju slučajeva, u određenim stadijumima bolesti, uzročnici se ne mogu izolovati klasičnim mikrobiološkim metodama. To je zbog činjenice da mikroorganizmi mogu biti unutra epitelne ćelije, u tkivima ili sluzi (na primjer, za klamidiju, mikoplazme, ureaplazme, sve viruse karakterizira intracelularna lokalizacija, a Trichomonas i gonokoki mogu biti i intra- i ekstracelularni). Osim toga, neke bakterije, pod utjecajem određenih faktora, mogu prijeći u takozvane nekulturne oblike ili u nekultivirano stanje. Primjer je naučno i medicinsko istraživanje hlamidije. Trajanje detekcije Chlamydia trachomatis u žarištu infekcije upoređivano je metodama kulture tkiva, direktnom fluorescencijom, PCR-om (detekcija DNK) i Western blot-om (detekcija RNK). Utvrđeno je da metode za određivanje nukleinskih kiselina detektuju patogen u žarištu 4 sedmice duže (16 sedmica naspram 12 sedmica nakon primarne infekcije) od tradicionalnih metoda. U ovom radu je donet zaključak o mogućnosti prelaska klamidije tokom infektivnog procesa u nekultivisano stanje. U ovom stanju, klamidija nastavlja izazivati upalu ili perzistira u epitelnim stanicama, ali se mikrobiološki ne otkriva (6).

Trenutno je akumulirana vrlo velika količina materijala koji ukazuje na relevantnost molekularne dijagnostike, ali ne možemo razmatrati druge primjere zbog ograničenog obima ove publikacije.

Strategija upotrebe laboratorijskih dijagnostičkih metoda

U sadašnjoj fazi razvoja laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti očigledna je potreba za integriranim pristupom koji se sastoji u korištenju različitih laboratorijskih metoda za postavljanje etiološke dijagnoze zarazne bolesti. Liječnik odlučuje o korištenju jedne ili druge metode laboratorijskog istraživanja nakon proučavanja anamneze i kliničkih manifestacija. Koriste se različite kombinacije metoda u zavisnosti od karakteristika biologije patogena i njihove interakcije sa imunološki sistem osobu, kao i oblik bolesti.

Na primjer, za laboratorijsku dijagnostiku klamidije, virusa herpes grupe, toksoplazme, analiziraju se rezultati PCR i ELISA studija. A u laboratorijskoj dijagnozi mikoplazmoze i ureaplazmoze koristi se kombinacija PCR-a s izolacijom kultura uz određivanje osjetljivosti na antibiotike. Za identifikaciju nespecifične oportunističke mikroflore koristi se mikroskopija razmaza i mikrobiološka metoda izolacije kulture.

Kliničar postavlja dijagnozu na osnovu proučavanja anamneze pacijenta, kliničkih manifestacija i laboratorijskih dijagnostičkih podataka.

književnost:

Spolno prenosive infekcije, br. 2, str. 21-24, 2002. Urogenitalna klamidijska infekcija. Pristupi dijagnostici i terapiji. G.A. Dmitriev, TsNIKVI Ministarstvo zdravlja Ruske Federacije, Moskva.
Tutorial. Sveruski obrazovni, naučni i metodološki centar za kontinuirano medicinsko i farmaceutsko obrazovanje. Moskva, 1999. Mikroekologija vagine. Korekcija mikroflore kod vaginalne disbakterioze. V.M. Koršunov, ... L.I. Kafarskaja, ... V.V. Smeyanov. Ministarstvo zdravlja Ruske Federacije, Ruski državni medicinski univerzitet, MIMSR, RMAPO, Moskva.
Spolno prenosive infekcije, br. 1, str. 8-15, 2002. Aktuelno stanje pitanja značaja Ureaplasma urealiticum u genezi urogenitalnih bolesti. IN AND. Kisina, O.S. Zagrebina, K.I. Zabirov, V.V. Meshkov. TsNIKVI Ministarstva zdravlja Ruske Federacije, Gradska klinička bolnica br. 47 Ministarstva zdravlja, Moskva.
Karcinogeneza. Tim autora koji je uredio D.G. Zaridze. Scientific world, 2000, Moskva. Papiloma virusi i njihova uloga u karcinogenezi grlića materice. F.L. Kiselev. Centar za istraživanje raka Ruske akademije medicinskih nauka.
Medicinski laboratorijska dijagnostika(programi i algoritmi). Priručnik, urednik prof. A.I. Karpishchenko, 2001, Intermedica, Sankt Peterburg.
Zaraziti. Immun., maj 1992, 2040-2047, tom 60, br. 5. Demonstracija hlamidijske RNK i DNK tokom kulture negativnog stanja. SM Holland, …HR Taylor. Odsjek za infektivne bolesti, bolnica Johns Hopkins, Baltimore, Maryland.

Sve više se počeo koristiti u medicinskoj praksi nova metoda dijagnostika zaraznih bolesti, koja ima skraćenicu PCR. Koja je suština ove metode istraživanja i koje se bolesti mogu otkriti zahvaljujući njoj, kao i koje su prednosti PCR-a u odnosu na druge uobičajene dijagnostičke metode i kako se pravilno pripremiti za analizu, možete saznati čitajući ovaj članak .

Šta je PCR?

Skraćenica PCR označava lančanu reakciju polimeraze. Ovo je sposobnost segmenta DNK da se proporcionalno razmnožava kada neophodni uslovi. PCR-dijagnostika infekcija izmišljena je još 1980-ih. Na otkriću su radili evropski, američki i sovjetski naučnici, tako da nije moguće odrediti pionira inovativne dijagnostičke metode. Osim toga, od 1983. godine, kada je službeno registrirana takva metoda za proučavanje zaraznih bolesti kao što je PCR, nastavljen je rad na poboljšanju ove metode. Danas se ova dijagnostička metoda koristi u gotovo svakoj medicinskoj laboratoriji koja ima neophodnu savremenu opremu.

Kako se radi analiza?

Za PCR analizu, u zavisnosti od medicinske indikacije, potrebno je provesti medicinsko uzorkovanje materijala kao što su krv, pljuvačka, urin, sperma, majčino mlijeko ili sekret genitalija, epitelne ćelije. Dijagnoza infekcija pomoću PCR-a je otkrivanje DNK patogena u test materijalu. Uz pomoć posebnih laboratorijskih manipulacija pomoću kemijskih reagensa i opreme, laboratorijski asistenti izvode lančanu reakciju polimeraze. Uz njegovu pomoć, dio DNK patogena koji je nevidljiv u mikroskopu raste do veličina koje su uočljive u uređaju. Zbog toga je moguće otkriti uzročnika infekcije čak i ako u testnom materijalu postoji neznatan dio njegove DNK.

Koje se infekcije mogu otkriti PCR-om?

Može otkriti niz patogenih mikroorganizama PCR dijagnostika infekcija. Tumačenje rezultata svodi se na otkrivanje patogena i određivanje njegovog tipa. Za dijagnozu se koristi lančana reakcija polimeraze razne bolesti ljudski: od spolno prenosivih do asimptomatskih, tzv skrivene infekcije. PCR nalazi:

virus hepatitisa (A, B, C);
ureplasma urealiticum;
ureplasma parvum;
chlamydia trachomatis;
candida
mycoplasma hominis;
mycoplasma genitalium;
garganella vaginalis;
trihomonijaza;
mycobacterium tuberculosis;
herpes simplex virus tip 1 i 2;
papiloma virus;
Epshetain-Barr virus;
helicobacter pylori;
virus imunodeficijencije.

Gore navedeni mikroorganizmi uzrokuju bolesti kao što su hepatitis, tuberkuloza, SPI i AIDS.

PCR dijagnostika infekcija provodi se u obliku kvalitativne (odnosno, utvrđuje se prisutnost ili odsutnost patogena) i kvantitativne analize (izračunava se broj mikroba u tijelu - ovaj pristup je neophodan, npr. u dijagnostici HIV infekcija i hepatitisa).

Prednosti dijagnostičke metode

Gotovo svaki laboratorij danas dijagnosticira ljudske infekcije pomoću lančane reakcije polimeraze. Koje su prednosti ove metode, zašto je za tako kratko vrijeme postala nevjerovatno popularna i među ljekarima i među pacijentima? Tako brzo širenje inovativne tehnologije objašnjava se visokim nivoom pouzdanosti, efikasnosti i osjetljivosti. Razmotrimo detaljnije prednosti PCR dijagnostičke metode:

Proces analize je maksimalno automatizovan, čime se eliminiše ljudski faktor tokom proučavanja i interpretacije rezultata.
Hvala za moderne tehnologije kulture se uzgajaju u roku od 4-6 sati, te shodno tome rezultate analize možete dobiti na dan kada se materijal preda na istraživanje.
PCR dijagnostika infekcija je vrlo osjetljiva, što omogućava otkrivanje patogena čak i u prisustvu malog dijela DNK. U nekim slučajevima, na primjer, kod sporih i asimptomatskih bolesti, sjetva usjeva drugom metodom je teška ili potpuno nemoguća.
Materijal za PCR istraživanje može biti krv, pljuvačka, urogenitalni sekret, epitelne ćelije, urin, sperma, što je izuzetno zgodno kada je nemoguće uzeti određeni materijal za analizu. Za dijagnozu zaraznih bolesti obično se koristi venska krv i urogenitalni bris.
Metoda lančane reakcije polimerazom može identificirati nekoliko patogena iz istog materijala. Ovaj pristup ne samo da smanjuje vrijeme za rješavanje problema tačna dijagnoza ali i štedi troškove istraživanja.
PCR metoda se smatra pouzdanom, jer je zabilježen samo mali broj lažno negativnih rezultata. Do danas nisu zabilježeni lažno pozitivni odgovori.

Kada se koristi PCR dijagnostika?

Bez obzira na prednosti PCR dijagnostike infekcija, ova metoda se ne koristi uvijek. Na primjer, prilikom dijagnosticiranja toksoplazmoze, polimerazna lančana reakcija se provodi samo ako je ELISA analiza pokazala sumnjiv ili kontroverzan rezultat. Koristeći PCR metodu, nemoguće je pratiti dinamiku bolesti. Bilješka sledećim slučajevima kada će ova metoda istraživanja donijeti pouzdane i učinkovite rezultate:

za utvrđivanje zaraznih bolesti navedenih u odgovarajućem dijelu članka;
rasprostranjena PCR dijagnostika urogenitalnih infekcija;
za utvrđivanje SPI tokom trudnoće;
za dijagnozu HIV-a;
u kontroverznim medicinskim situacijama potvrditi ili opovrgnuti preliminarnu dijagnozu;
utvrđivanje očinstva i porodičnih veza;
koristi se u genotipizaciji za otkrivanje nasljednih predispozicija;
pomaže PCR metoda zaposleni u odjeljenju sudske medicine radi identifikacije genetskog materijala.

PCR tokom trudnoće

Pregled PCR metodom obavezan je za trudnicu prilikom registracije radi rane dijagnoze polno prenosivih infekcija. Budući da su takve bolesti izuzetno opasne za normalan tok perioda rađanja djeteta. SPI izazivaju blijedi razvoj fetusa, pobačaje, intrauterine deformitete, mrtvorođenost, kongenitalne patologije. Pravovremeno otkrivanje i liječenje infekcije značajno povećavaju šanse za povoljan ishod trudnoće i rođenje zdrave bebe.

Obično buduca majka imenovan sveobuhvatan pregled, koji nosi naziv "PCR 6". Takva studija uključuje analizu 6 različitih infekcija. PCR dijagnostika se obavlja u javnim i privatnim ustanovama: Invitro, Happy Family, Uro-Pro i druge laboratorije nude ovu uslugu. Ovaj problem je detaljnije opisan u nastavku.

Stoga će biti potrebno samo jednom uzeti materijal na analizu. Prilikom provođenja PCR dijagnostike u trudnoći potreban je urogenitalni bris koji se ginekološkom četkicom uzima iz cervikalnog kanala. Ova procedura nije bol kod trudnice i ni na koji način ne utiče na fetus.

PCR za određivanje hepatitisa

PCR dijagnostika se često propisuje za otkrivanje uzročnika hepatitisa. To se objašnjava činjenicom da je takva bolest često asimptomatska i prelazi u kroničnu tešku neizlječivu fazu. Uz pomoć PCR-a, hepatitis se otkriva u najranijim fazama, što doprinosi povoljnom izlječenju u najkraćem mogućem roku. Takva PCR dijagnostika infekcija provodi se u većini privatnih laboratorija. Cijena ovisi o vrsti virusa koji se utvrđuje i vrsti analize. Dakle, jednostavno određivanje prisustva ili odsustva DNK patogena u krvi košta 400-600 rubalja. Kvantitativna metoda koštat će 1200-1500 rubalja.

Sveobuhvatna studija PCR-om

Za još efikasniju efikasnost PCR metode u dijagnostici zaraznih bolesti, široko se koristi sveobuhvatna studija, što pomaže da se skrati vrijeme postavljanja dijagnoze i pravovremenog liječenja. Dakle, laboratorije nude analizu "PCR-6" i "PCR-12". Prvi kompleks uključuje PCR dijagnostiku genitalnih infekcija, kao što su:

ureplasmosis;
klamidija;
mikoplazmoza;
humani papiloma virus;
jednostavan herpes;
citomegalovirus.

Takva studija se često dodjeljuje ženama na ranih datuma trudnoće, kao i tokom planiranja začeća.

Tokom "PCR-12", pored navedenih bolesti, dijagnostikuju se i:

gonoreja;
kandidijaza;
bakterijska vaginoza;
trihomonijaza;
ureplasmosis;
herpes 1 i 2 tipa.

Ovisno o laboratoriji, lista proučavanih bolesti uključenih u kompleks može varirati. Doktor će odabrati svaki konkretan slučaj najprikladniji pregled. U svakom slučaju, sveobuhvatna analiza PCR-om će oduzeti mnogo manje vremena, truda i materijalnih troškova.

PCR dijagnostika infekcija: kako proći?

Priprema za PCR analizu sastoji se u pridržavanju preporuka za prikupljanje određene vrste materijala:

Prolazeći urogenitalni bris, treba se suzdržati od seksualnog kontakta tri dana prije predložene analize, prestati uzimati antibakterijski lijekovi i lokalne masti, kreme, supozitorije, nemoguće je provesti postupak ispiranja. Tokom menstrualnog toka, uzorkovanje materijala se ne vrši - potrebno je izvršiti analizu ne ranije od 3 dana nakon završetka menstruacije. Treba se suzdržati od mokrenja 3 sata prije analize.
Vensku krv je bolje darovati ujutro, na prazan želudac (iako to nije pravilo). Dan ranije treba ograničiti konzumaciju alkohola i masne hrane.
Prilikom doniranja sperme morate se suzdržati od seksualnog kontakta tri dana. Preporučljivo je ograničiti upotrebu alkohola, odlazak u saunu, uzimanje tople kupke.
Urin treba uzimati ujutro, nakon temeljnog toaleta genitalija. Bolje je prikupiti materijal u posebnu sterilnu posudu. Materijal treba dostaviti u laboratoriju u roku od nekoliko sati.

Kako dešifrirati rezultat?

Nije teško protumačiti rezultate nakon provedene PCR dijagnoze infekcija. Dešifrovanje kvalitativne metode sastoji se u proceni prisustva ili odsustva patogena u ispitivanom materijalu, kao i u određivanju vrste patogenog mikroorganizma. Ako je u ispitivanom materijalu pronađen dio DNK mikroba, tada se na odgovarajućem obrascu upisuje pozitivan rezultat, a također se navodi koja je vrsta mikroba određena. U nedostatku patogenog mikroorganizma u materijalu, rezultat će biti negativan.

Rezultati kvantitativne analize, na primjer, u dijagnozi hepatitisa, moraju se dešifrirati korištenjem standarda koje je odredila laboratorija. Budući da se mjerne jedinice i kvantitativni faktor značajno razlikuju u različitim medicinskim dijagnostičkim ustanovama. Pouzdano, uzimajući u obzir sve popratne faktore, samo liječnik može dešifrirati takvu analizu.

PCR metoda (lančana reakcija polimeraze) je "zlatni standard" moderne DNK dijagnostike, visoko osjetljiva metoda molekularne biologije. koristi se u medicini, genetici, forenzici i drugim poljima. Često se i uspješno koristi u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti.

Dijagnoza zaraznih bolesti PCR-om

Studija PCR-om omogućava vam da u testnom materijalu otkrijete ne samo sam patogen, već čak i jedan fragment stranog DNK. Istraženi (biološki) materijal je: deoksigenirana krv, epitelnih ćelija i sekreta genitalnog trakta, sjemena, pljuvačke, sputuma i drugih bioloških izlučevina. Potreban biološki materijal određuje se prema sumnjivoj bolesti.

PCR metoda u naše vrijeme je, naravno, moćan dijagnostički alat. Možda je jedini nedostatak studije njegova visoka cijena.

Na listi bolesti, čije se prisustvo može utvrditi PCR-om, nalaze se:

virusna i bakterijska pneumonija;
tuberkuloza;
boginje, rubeola, zaušnjaci;
infektivni hepatitis svih oblika;
salmoneloza, difterija;
Helikobakterioza i bolesti uzrokovane crijevne infekcije;
Polno prenosive bolesti (polno prenosive bolesti): gonoreja, klamidija, ureaplazmoza, sifilis, AIDS, genitalni herpes, gardnereloza i dr.

Pregled na SPI pomoću PCR

Za razliku od tradicionalnih testova, PCR tehnika može otkriti spolno prenosive infekcije (STI) čak iu odsustvu njihovih znakova. Za uzimanje biološkog materijala, žene rade struganje epitelnih ćelija cervikalnog kanala, muškarcima - struganje uretre. Ako je potrebno, PCR se koristi za proučavanje venske krvi.

Dakle, PCR test za spolno prenosive infekcije omogućava identifikaciju:

virus humane imunodeficijencije (HIV);
blijeda treponema (uzročnik sifilisa);
herpes simplex virus i citomegalovirus;
humani papiloma virus (HPV);
klamidija, toksoplazma, mikoplazma, ureaplazma i druge seksualne infekcije.

Pod uslovom da se PCR analiza pravilno izvede, isključena je verovatnoća lažno pozitivnih rezultata. Posebno treba spomenuti humani papiloma virus (HPV) i značaj PCR metode za njegovu dijagnozu. Za razliku od onkocitološkog razmaza, PCR može odrediti specifičnu vrstu HPV-a, posebno njegove onkogene tipove 16 i 18, čije prisustvo prijeti ženi tako ozbiljnom i često smrtonosnom bolešću kao što je. Pravovremeno otkrivanje onkogenih tipova HPV-a PCR-om često omogućava prevenciju razvoja raka grlića materice.

Enzimski imunotest (ELISA) i lančana reakcija polimeraze (PCR): prednosti i nedostaci

Koja dijagnostička metoda je bolja: PCR ili ELISA? Ne postoji tačan odgovor na ovo pitanje, jer, u suštini, dijagnoza pomoću ove dvije studije ima različite ciljeve. Štaviše, ELISA i PCR metode se češće koriste u kombinaciji.

PCR studija je neophodna za određivanje specifičnog uzročnika infekcije, može se otkriti odmah nakon infekcije, unatoč odsustvu simptomatskih manifestacija bolesti. Ova metoda je idealna za otkrivanje latentnih i kroničnih bakterijskih i virusne infekcije.Uz njegovu pomoć istovremeno se može otkriti nekoliko patogena, a tijekom terapije PCR metoda omogućuje procjenu njegove kvalitete određivanjem broja kopija strane DNK.

Za razliku od PCR tehnike, ELISA metoda je dizajnirana da otkrije ne sam infektivni agens, već imuni odgovor tijela na njega, odnosno da identificira prisutnost i količinu antitijela na određeni patogen. U zavisnosti od vrste otkrivenih antitijela (IgM, IgA, IgG), moguće je odrediti stupanj razvoja infektivnog procesa.

Obje metode, PCR i ELISA, su visoko pouzdane (100 i 90%, respektivno). No, važno je napomenuti činjenicu da ELISA analiza u nekim slučajevima daje lažno pozitivan (ako je osoba u prošlosti imala određenu bolest) ili lažno negativan (ako je infekcija prošla relativno nedavno) rezultat.

Danas se PCR analiza smatra jednom od najpouzdanijih metoda za dijagnosticiranje različitih zaraznih bolesti. Osim toga, metoda postaje sve dostupnija. Zbog visokog stepena specifičnosti, mogućnost dobijanja lažnih rezultata je isključena.

Metodologija analize

Tokom analize ispitni materijal se stavlja u poseban uređaj. Dodajte enzime koji su uključeni u formiranje genetskog materijala. Nadalje, dolazi do ponovnog kopiranja DNK ili RNK patogena. Iz ciklusa u ciklus, broj kopija DNK raste do količine pri kojoj je lako identificirati patogen.

PCR test krvi se najčešće koristi u kliničku praksu kako bi se utvrdio zarazni uzrok bolesti. Također je moguće proučavati urin, bris iz ždrijela i drugo biološki materijali. Kod žena se za PCR analizu koriste sekreti iz genitalnih organa, cervikalni kanal. Istovremeno, važno je znati kako se pripremiti za PCR analizu kod žena kako bi rezultat bio što pouzdaniji. Glavna stvar je da se pridržavate sljedećih pravila:

apstinencija od seksualnih odnosa tri dana prije testiranja;
večina bakterije se mogu "isprati" u urinu, tako da ne biste trebali mokriti prije studije;
ne provodite istraživanje odmah nakon menstruacije, morate pričekati 3-5 dana nakon završetka.

Ne postoji posebna priprema prije analize krvi.

PCR - šta pokazuje analiza?

Poznato je da PCR analiza pokazuje prisustvo različitih virusnih i bakterijske infekcije. Ova metoda je također učinkovita za otkrivanje latentnih, kroničnih infekcija. PCR analiza na SPI omogućava izolaciju patogena čak iu prisustvu pojedinačnih ćelija virusa i bakterija. Vrijedi napomenuti koji su PCR testovi uključeni u blok genitalnih infekcija, a to su:

klamidija;
ureaplazme (parvum i urealiticum);
uzročnik gonoreje;
Razne vrste humani papiloma virus;
trichomonas;
gardnerella;
candida.

Kod infektivnih bolesti genitalnih organa materijal za PCR je bris iz cervikalnog kanala, uretre i vagine. Pripremi za začeće treba pristupiti s velikom odgovornošću. Prilikom planiranja trudnoće, PCR testovi su neophodni u slučaju kada postoje sumnje na najčešće zarazne bolesti. A u prisustvu infekcije, bolje je odgoditi trudnoću. Vrijedi napomenuti da se testovi za identifikaciju gore navedenih patogena moraju proći ne samo na ženu, već i na muškarca.

Također, PCR metoda vam omogućava da identificirate sljedeće patogene:

virusi hepatitisa B i C;
mycobacterium tuberculosis;
virusi porodice herpesa, uključujući Epstein-Barr virus i citomegalovirus;
infekcija helikobakterom.

Interpretacija rezultata

Dešifriranje PCR analize nije teško. Obično se rezultati PCR analiza mogu dobiti na sljedeći način:

U nekim slučajevima se provodi kvantitativno određivanje mikroorganizama. Ovo se posebno odnosi na bolesti uzrokovane oportunističkim patogenima. Budući da ove bakterije pokazuju svoje negativno djelovanje samo kada su u višku. Takođe, kvantitativna PCR analiza je važna za izbor terapijske taktike i u svrhu praćenja liječenja virusnih infekcija kao što su HIV i virusi hepatitisa.